發(fā)布時間：2018-01-10 02:17

  本文關(guān)鍵詞：西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖抑制作用和在細胞中的代謝研究　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:神經(jīng)母細胞瘤是一種罕見的惡性腫瘤,高發(fā)于5歲以下的兒童。目前能夠治療該疾病的藥物很少,所以尋找有效藥物很有必要。西瑞香素(Daphnoretin),化學名7-為羥基-6-甲氧基-3,7'-雙香豆素酯,又稱雙白瑞香素,具有以醚鍵結(jié)合的雙香豆素類衍生物的結(jié)構(gòu),在菊科、瑞香科等植物中均有發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)西瑞香素具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗焦慮等藥理作用,所以本實驗采用該藥物進行研究,探索其能否對神經(jīng)母細胞瘤細胞有效。目的:通過進行神經(jīng)母瘤細胞SH-SY5Y的增殖抑制、凋亡、周期實驗,研究該化合物是否對神經(jīng)母瘤細胞起作用。建立神經(jīng)母細胞瘤細胞中西瑞香素的HPLC檢測方法,通過西瑞香素在神經(jīng)母瘤細胞中的攝取和消除實驗為西瑞香素的細胞藥代動力學研究提供初步的理論依據(jù)。探索西瑞香素能否成為治療人神經(jīng)母細胞瘤的藥物,為治療該疾病提供幫助。方法:采用經(jīng)典的MTT(四氮唑鹽)法,計算西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞不同給藥濃度下的存活率,來評價西瑞香素對腫瘤細胞的增殖抑制作用。標記了FITC的AnnexinV可以作為熒光探針結(jié)合早期凋亡神經(jīng)母細胞瘤細胞上的磷脂酰絲氨酸,PI(碘化丙啶)核酸染料可以與凋亡中晚期細胞和壞死細胞的細胞核結(jié)合,兩種染料同時使用可將早期凋亡和晚期、壞死的細胞區(qū)分開,實驗采用熒光顯微鏡觀察不同濃度西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞的凋亡情況的影響。采用PI染色法對給藥細胞進行染色,用流式細胞儀檢測西瑞香素對神經(jīng)母瘤細胞周期的影響。用JC-1染色法檢測西瑞香素對細胞線粒體膜電位的影響。采用細胞劃痕實驗檢測西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞的遷移能力的影響。建立細胞內(nèi)西瑞香素的HPLC含量測定方法,并對方法學進行驗證。然后用建立的方法測定在一定時間內(nèi),細胞對西瑞香素的攝取和消除情況,研究血清和維拉帕米對西瑞香素在SH-SY5Y細胞中含量是否有影響。結(jié)果:MTT試驗結(jié)果表明,西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y有增殖抑制作用。神經(jīng)母瘤細胞的凋亡實驗結(jié)果表明西瑞香素能夠誘導細胞的凋亡,濃度為10μg/mL時,主要誘導細胞早期凋亡,隨著給藥濃度的增加晚期和壞死細胞數(shù)量增加。細胞周期試驗顯示,給藥后神經(jīng)母細胞瘤細胞在S期的比例升高,說明西瑞香素能夠阻滯細胞周期,主要是阻滯細胞由S期向G2期的進行。JC-1染色法實驗結(jié)果表明西瑞香素能夠降低線粒體膜電位,進一步驗證西瑞香素能夠誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞發(fā)生凋亡。細胞劃痕實驗證明西瑞香素對神經(jīng)母細胞瘤細胞的遷移能力也有影響。細胞藥代動力學方法學試驗結(jié)果:用Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5μm),流動相為甲醇-磷酸水溶液(55:45,v/v,pH≈3.0),流速1.0 mL/min。檢測波長345 nm,柱溫30 0C分離效果良好。本方法在0.02-20.0μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好,最低定量限為0.05μg·mL-1,標準線性方程為Y=80620X+5962,R2大于0.99。低、中、高3個質(zhì)量濃度1.0,5.0,10.0μg·mL-1的西瑞香素第一天的日內(nèi)精密度的RSD分別是:9.34%,2.97%,2.24%;第二天的日內(nèi)精密度是9.55%,2.27%,4.60%;第三天的日內(nèi)精密度為6.35%,1.54%,2.74%;日間精密度是8.91%,2.41%,3.61%。準確度的RSD值是5.69%,6.11%,3.35%;室溫立即處理、在室溫放置24h、4℃放置24h穩(wěn)定性實驗結(jié)果分別是14.85%,6.03%,8.29%;11.97%,3.16%,5.54%;11.11%,4.67%,5.02%。提取回收率不同濃度的提取回收率的RSD值分別為:2.18%,1.65%,3.49%。所有RSD%均小于15%,說明建立的HPLC方法學可用。超聲裂解結(jié)果表明裂解30 min檢測藥物含量最高。西瑞香素的攝取量與時間相關(guān)隨著時間的增加攝取量增加,在6-8h達到穩(wěn)態(tài),并且在含血清狀態(tài)下西瑞像素的攝取量比在無血清狀態(tài)下的攝取量高。消除實驗結(jié)果顯示,西瑞香素在細胞中的消除隨著時間逐漸減少。加入10μM、50μM的維拉帕米與不含維拉帕米組的細胞中西瑞香素的量沒有顯著性差異,說明西瑞香素轉(zhuǎn)運過程中不存在P-糖蛋白的外排作用。討論:實驗發(fā)現(xiàn)該藥對神經(jīng)母細胞瘤細胞有一定的增殖抑制作用,能夠誘導細胞凋亡,對細胞周期和遷移能力也有一定的影響。本實驗建立的西瑞香素細胞樣品檢測的HPLC方法效率高、專屬性高、靈敏度較好,可對細胞藥動學研究提供方法學的依據(jù)。西瑞香素在細胞中的攝取和消除作用研究,可為探索西瑞香素在細胞內(nèi)的作用機制打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : To study the effect of ciresinol on the cell cycle of neuroblastomas by means of MTT ( MTT ) method .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1403455