本文關(guān)鍵詞：TGF-β及其受體信號通路在氟調(diào)控破骨細胞分化中的作用　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景:轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)作為轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的多功能細胞因子,其產(chǎn)生于細胞分化的各個階段,在骨組織中的含量尤為豐富。TGF-β可以由骨中的許多細胞產(chǎn)生并分泌在骨基質(zhì)中,研究證明了TGF-β在破骨細胞的分化和骨的重吸收過程中發(fā)揮重要的作用。在氟骨癥發(fā)病過程中,氟能夠刺激成骨細胞和破骨細胞,均表現(xiàn)出不同程度的活躍性,但是對于在骨的重吸收過程中發(fā)揮主要作用的破骨細胞研究甚少。本實驗從體內(nèi)、體外兩個方面進行研究,探究TGF-β在氟調(diào)控的破骨細胞中的作用,這在以往的氟骨癥機制研究中罕見報道。本實驗研究成果將為氟骨癥及相關(guān)代謝性骨病的研究提供線索和理論依據(jù)。實驗方案:1.體內(nèi)實驗:60只清潔級雄性成年Wistar大鼠平均分為對照組、低氟組和高氟組。三組大鼠給予氟處理1個月后,每組中選取一半的大鼠進行SB431542試劑處理,實驗最后分為6組:對照組,10mg F-/kg·day組,20mg F-/kg·day組,SB431542組,10mg F-/kg·day+SB431542組,20mg F-/kg·day+SB431542組。投氟聯(lián)合SB431542繼續(xù)處理1個月后,乙醚麻醉處死大鼠,經(jīng)眼球取血進行生化分析,收集股骨、脛骨等骨組織進行HE染色、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析。我們主要觀察了氟中毒大鼠骨組織的病理形態(tài)、骨保護素蛋白表達以及成骨、破骨標志物水平。該實驗主要考察氟中毒大鼠復制氟骨癥模型、骨轉(zhuǎn)換特征和TGF-β受體抑制劑對氟骨癥骨吸收病理過程的影響。2.體外實驗:我們以小鼠單核細胞系RAW264.7為研究對象,采用培養(yǎng)基加RANKL(25ng/m L)誘導單核細胞融合成破骨細胞前體,作為考察氟誘導破骨細胞增殖和分化的體外模型。實驗設(shè)為對照組,1、4、16mg F-/m L三個梯度氟組以及SB431542組和三個梯度氟聯(lián)合SB431542組,共8組。RAW264.7細胞在RANKL存在的條件下,分別給予氟濃度分別為0,1,4,16 mg F-/m L,以及氟聯(lián)合抑制劑SB431542(濃度為10μmol/L)進行處理,培養(yǎng)7天后進行實驗檢測。采用MTT法檢測不同條件下的細胞活性;將RANKL誘導RAW264.7細胞接種在骨磨片上,培養(yǎng)7天后,對骨片進行甲苯胺藍染色,光鏡下觀察各組形成骨陷窩的形態(tài)并進行不同條件下破骨細胞樣細胞骨吸收能力的比較分析;利用實時聚合酶鏈式反應(yīng)和蛋白雜交技術(shù)分別檢測了暴露于不同條件下RAW264.7細胞內(nèi)破骨相關(guān)及TGF-β信號通路各因子在基因和蛋白水平的表達變化。3.mi RNA表達分析:RAW264.7細胞在RANKL存在的條件下,給予氟濃度8mg F-/L培養(yǎng)液處理7天。采用Affymetrix mi RNA 4.0芯片進行染氟組與對照組細胞mi RNA表達譜分析,利用Volcano Plot filtering觀察mi RNA基因表達量的變化,與對照組比較倍數(shù)改變值≥2.0或≤-2.0即為明顯差異表達的mi RNA。最后用層次聚類法分析明顯差異基因的表達框架。實驗結(jié)果:1.體內(nèi)實驗:投氟大鼠隨著投氟時間延長和投氟量的加大,氟斑牙病損和骨轉(zhuǎn)換活躍狀態(tài)更加顯著。SB431542聯(lián)合氟處理組大鼠的氟斑牙損害程度比相同投氟條件下大鼠牙齒損害加重,但是骨組織病理性骨轉(zhuǎn)換特征被抑制。與之相對應(yīng)的是氟能夠促進大鼠血清內(nèi)PINP和CTX的濃度提高,而單獨SB431542處理顯著抑制了兩者的表達;氟降低了大鼠的骨密度,而且高氟組大鼠明顯比低氟組大鼠骨密度低,骨密度變化情況與前面的病理結(jié)果相互支持。此外,大鼠骨組織抑制破骨關(guān)鍵因子OPG蛋白表達明顯降低,SB431542促進骨髓B細胞前體表達OPG。大鼠暴露于不同氟水平能夠引起活躍骨轉(zhuǎn)換,造成不同程度的成骨和破骨活動加強。SB431542作為TGF-β1細胞內(nèi)受體抑制劑能夠抑制骨轉(zhuǎn)換,明顯影響氟引起的骨轉(zhuǎn)換狀態(tài),說明TGF-β1在氟刺激的骨轉(zhuǎn)換機制中扮演著重要角色。2.體外實驗:結(jié)果表明低量氟顯著刺激RAW264.7細胞活性,高量氟早期也能促進該細胞活性,但是隨著氟作用時間的延長,細胞活性受到抑制。同樣地,低量氟對RAW264.7細胞誘導破骨細胞骨吸收能力和破骨細胞分化特征的細胞數(shù)具有顯著的刺激作用,高氟卻抑制這種作用。經(jīng)過破骨細胞分化標志物TRAP和調(diào)控因子RANK表達在染氟破骨細胞樣細胞內(nèi)的變化,證明了氟對破骨細胞分化成熟的刺激作用,并且伴隨著TGF-β1細胞內(nèi)兩個受體及其下游磷酸化Smad3的表達。然而,氟對破骨細胞樣細胞的刺激作用在聯(lián)合給予TGF-β1細胞內(nèi)受體抑制劑SB431542后顯著下降;相應(yīng)地,磷酸化Smad3和TβR1的表達比單獨氟作用組細胞明顯降低。這些結(jié)果提示了TGF-β1在氟作用破骨細胞分化和功能機制中有著重要作用。3.mi RNA芯片分析:結(jié)果顯示出染氟能夠促進破骨細胞前體細胞內(nèi)的誘導細胞分化及參與調(diào)控的IGF1和TGF-β1等的mi RNA表達顯著增加。我們知道每個mi RNA可以有多個靶基因,而幾個mi RNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。在本實驗經(jīng)過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)了氟刺激了多個參與調(diào)控破骨細胞分化信號通路,如IGF1和TGF-β1及其細胞內(nèi)下游信號因子Smad3、MAPK等的mi RNA變化。結(jié)論:低量氟對破骨細胞活性、分化和功能具有顯著的刺激作用,高氟作用一定時間后卻能抑制這種刺激作用,并阻礙破骨細胞的分化和功能。TGF-β1在氟作用破骨細胞分化和功能機制中有著重要作用,氟很可能通過TGF-β1細胞內(nèi)的TβR1-磷酸化Smad3信號通路發(fā)揮這種刺激作用。同時,氟可以同時刺激破骨細胞內(nèi)多個參與調(diào)控破骨細胞分化信號通路,如IGF1和TGF-β1及其細胞內(nèi)下游信號因子Smad3、MAPK等的mi RNA變化,這為我們下一步分析氟誘導破骨精細調(diào)控機制提供了線索。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R599.1

【參考文獻】

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本文編號：1392901