本文關(guān)鍵詞：阿奇霉素注射液潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制研究　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:阿奇霉素是臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥,不良反應(yīng)相對(duì)較少。但近幾年,有越來越多的證據(jù)表明阿奇霉素可能增加心血管死亡風(fēng)險(xiǎn),尤其是心律失常的發(fā)生�？v觀大量文獻(xiàn)報(bào)道,未見有對(duì)其在動(dòng)物水平上的致心律失常的機(jī)制研究。為了驗(yàn)證這一風(fēng)險(xiǎn)存在的真實(shí)性,降低臨床用藥的不良反應(yīng)發(fā)生率,所以我們對(duì)此藥進(jìn)行了一系列基礎(chǔ)的心臟安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。藥物與試劑馬來酸阿奇霉素注射液(津博),規(guī)格0.25 g,從南京市仙林鼓樓醫(yī)院購買,生產(chǎn)批號(hào)081406026,國藥準(zhǔn)字H20020293,生產(chǎn)廠家:天津生物化學(xué)制藥有限公司。其他化學(xué)試劑大部分購自Sigma公司,小部分購自國產(chǎn)代理商。動(dòng)物豚鼠,質(zhì)量250～350g,雄性,由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2013-0006。方法:1.豚鼠在體心電圖記錄:20%烏拉坦(5 mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔麻醉,以仰臥位進(jìn)行固定,分出一側(cè)頸靜脈,進(jìn)行插管,再給藥。四肢皮下扎入針形電極引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電信號(hào),經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計(jì)算機(jī)。于靜脈推注藥物5 min后記錄心電圖,分析心率(HR)、P-R間期、QRS間期和QTc間期。按照阿奇霉素注射液說明書規(guī)定的:成人用量為每人每天500 mg(靜脈滴注),在體實(shí)驗(yàn)采用500 mg為1倍臨床劑量,即8.3 mg/kg.(按成人60 kg計(jì)算)。人體與動(dòng)物用藥量按體表面積系數(shù)計(jì)算,以每公斤體重進(jìn)行比較。國際標(biāo)準(zhǔn):豚鼠的劑量為人用劑量的4.6倍,基于這種換算原則,豚鼠在體一倍劑量為38.2 mg/kg,依次類推。2.豚鼠離體心電圖記錄:20%烏拉坦(5 mL/kg)對(duì)豚鼠腹腔注射麻醉,固定后迅速開胸取出心臟,置于0℃C的無鈣灌流液中。應(yīng)用改進(jìn)的Langendorff裝置灌流系統(tǒng),經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行離體心臟灌流,心臟復(fù)跳后在心外膜下置3根銀絲電極:正極置于心尖處,負(fù)極置于右心房,接地電極置于主動(dòng)脈根部,引導(dǎo)出離體心臟心電圖。待豚鼠心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后,信號(hào)經(jīng)四道生理記錄儀輸入計(jì)算機(jī)記錄,分析心率(HR)、P-R間期、QRS間期和QTc間期。按照阿奇霉素注射液說明書規(guī)定的:成人用量為每人每天500 mg(靜脈滴注),即8.3 mg/kg(按成人60 kg計(jì)算)。成人細(xì)胞外液約占體重的20%,那么換算成臨床血藥濃度即為41.5 mg/L,據(jù)上述方法換算后,離體實(shí)驗(yàn)的組織和細(xì)胞灌流液1倍臨床濃度為41.5 mg/L。豚鼠的離體心臟心電圖實(shí)驗(yàn)按照1,5,10倍的臨床濃度給藥,每一濃度的灌流液體積為20 mL,灌流速度約2～3 mL/min。3.豚鼠左心室乳頭肌動(dòng)作電位記錄:用20%烏拉坦(5mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔麻醉,快速開胸取出心臟,置于0～4℃無鈣臺(tái)氏液中停止搏動(dòng),剪下左心室乳頭肌,將其固定于恒溫(35.5～36.5℃水浴槽底部。恒溫恒速條件下用含鈣臺(tái)氏液灌流,穩(wěn)定30 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。刺激頻率1Hz,波寬10 ms,強(qiáng)度1.5倍閾值的方波刺激。信號(hào)經(jīng)放大器、數(shù)模轉(zhuǎn)換器顯示于電腦屏幕并記錄在計(jì)算機(jī)內(nèi)部,分析動(dòng)作電位復(fù)極50%(APD50)及90%(APD90)水平的時(shí)程。4.豚鼠左心室單個(gè)肌細(xì)胞動(dòng)作電位記錄:用改良后的酶解法分離豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞。健康豚鼠,雄性,250～300g。腹腔注射20%烏拉坦(5mL/kg),在100%氧飽和的0℃無鈣臺(tái)氏液中清洗修剪,并將其固定在改良的Langendorff心臟灌流裝置上,在37℃的恒溫,充氧(95%O_2+5%CO_2)條件下,用無鈣灌流液持續(xù)逆向灌流,使心臟先復(fù)跳后停跳,再用含消化酶(Collage-naseⅡ2 mg/mL,胰蛋白酶0.1mg/mL)的無鈣灌流液反復(fù)灌流40min,至心臟膨大、松弛,最后再用適量KB液灌流沖洗。取下心臟,將消化后的左心室肌組織塊置于盛有KB液的玻璃皿中充分剪碎,用直徑200 μm的尼龍網(wǎng)過濾,將細(xì)胞懸液導(dǎo)入離心管中,靜置,KB液洗三次。最后置于室溫下備用。無鈣灌流液的組成(mM):NaCl 135,KC1 5.4,NaH_2PO_4 0.33,MgCl_2 1,HEPES 5,Glucose 10,pH 用 NaOH 調(diào)至 7.4。KB 液組成(mM):KC1 25,NaH_2PO_4 10,L-谷氨酸 70,Taurine 10,EGTA 0.5,HEPES 20,Glucose 11,KOH 85,pH 用 KOH 調(diào)至 7.4。采用膜片鉗全細(xì)胞電流鉗記錄方法,在室溫(22～25℃)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置顯微鏡上的灌流槽中,待細(xì)胞穩(wěn)定后,用細(xì)胞外液灌流。其組成為(mM):NaCl 117,KC15.7,NaHCO_3 4.4,MgCl_2 1.7,HEPES 20,Glucose 20,Taurine 20,CaCl_2 1.8,用 NaOH 調(diào)節(jié) pH至7.3。選取桿狀,橫紋清晰,表面無顆粒,無收縮的細(xì)胞進(jìn)行封接實(shí)驗(yàn)。玻璃毛細(xì)管經(jīng)微電極拉制儀兩步拉制成尖端直徑約為1μm的電極,電極充灌內(nèi)液后入水阻抗約2～5 MΩ,電極內(nèi)液組成(mM):KCl 135,EGTA 10,Glucose 5,HEPES 10,Na2-ATP 3,Na-GTP 0.5,pH用KOH調(diào)至7.1。調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細(xì)胞表面進(jìn)行封接。在電壓鉗模式下測電阻,當(dāng)封接電阻達(dá)到1GΩ以上后補(bǔ)充快電容,并給予負(fù)壓破膜形成全細(xì)胞記錄模式。在電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位,電信號(hào)由膜片鉗放大器放大,再經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換與計(jì)算機(jī)對(duì)接,在電腦屏幕上顯示出電變化,信號(hào)的發(fā)放、采集與數(shù)據(jù)分析均由Clampfit 10.4(Axon Instruments,USA)軟件完成,并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于電腦硬盤,分析動(dòng)作電位復(fù)極50%(APD50)及90%(APD90)水平的時(shí)程。5.全細(xì)胞電壓鉗記錄L型鈣電流:采用膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗記錄方法,在室溫(22～25℃)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置熒光顯微鏡上的灌流槽中,細(xì)胞穩(wěn)定后,用細(xì)胞外液灌流。L 型鈣電流(Ica-L)記錄細(xì)胞外液組成(mM):NaCl 132,CsCl 5.4,CaCl_2 1.8,MgCl_2 1.8,NaH_2PO_4 0.6,4-AP 5,HEPES 10,Glucose 10,Na-pyruvate 5,pH 用 NaOH 調(diào)至 7.4。電極內(nèi)液組成(mM):CsCl 130,MgCl_2 2,EGTA 11,HEPES 20,Glucose 10,Na_2-ATP 2,Na-GTP 0.1,pH 用 NaOH 調(diào)至 7.4。刺激程序:鉗制電壓為-80 mV,階躍到-40 mV并維持200 ms(使Na~+電流失活),然后施加到0 mV的300 ms試驗(yàn)電壓。6.全細(xì)胞電壓鉗記錄Na+電流:采用膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗記錄方法,在室溫(22～25℃C)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置熒光顯微鏡的灌流槽中,細(xì)胞穩(wěn)定后,用細(xì)胞外液灌流。鈉電流(INa)記錄細(xì)胞外液組成(mM):NaCl 70,Choline-Cl 70,KCl 5.4,MgCl_2 1,CaCl_2 0.1,HEPES 10,Glucose 10,NaH_2PO_4 0.33。用 NaOH將pH 值調(diào)至 7.3。電極內(nèi)液組成(mM):CsCl 120,EGTA 11,HEPES 10,Na_2-ATP 5,MgCl_2 5,CaCl_2 1,Glucose 11。pH 用 CsOH 調(diào)至7.3。刺激程序:在電壓鉗狀態(tài)下,以10 mV的階躍使心室肌細(xì)胞由-90 mV的保持電壓逐步去極化至+60 mV,刺激電壓持續(xù)60 ms。7.全細(xì)胞電壓鉗記錄快速延遲整流鉀電流(Ikr):采用膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗記錄方法,在室溫(22～25℃)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置熒光顯微鏡上的灌流槽中,細(xì)胞穩(wěn)定后,用細(xì)胞外液灌流�？焖傺舆t整流鉀電流(IKr)記錄細(xì)胞外液組成(mM):NaCl 140,KC1 5.4,MgCl_2 1,CaCl_2 1.5,Glucose 10,HEPES 10,pH 用 NaOH 調(diào)至 7.4。電極內(nèi)液組成(mM):KC1 140,MgCl_2 1,Na_2-ATP 4,EGTA5,HEPES 10,pH用KOH調(diào)至7.3。此外細(xì)胞外液中還需加入200μmol/L的 4-AP 阻斷 Ito,20μmol/L 的 Chromanol 293B 阻斷 Iks,200μmol/L 的 BaCl_2 阻斷 Ik1,10μmol/L的硝苯地平阻斷Ica-L。刺激程序:采用常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗記錄,實(shí)驗(yàn)在室溫(22～25 ℃C)下進(jìn)行,心室肌細(xì)胞鉗制在-40 mV,從-40 mV開始以階躍電壓10 mV的方式逐步去極化至60 mV,維持3000 ms,然后電壓復(fù)極至-40 mV,2000 ms誘發(fā)Ikr外向尾電流。結(jié)果:1.阿奇霉素注射液對(duì)豚鼠在體心臟心電圖的影響:結(jié)果顯示:阿奇霉素注射液1,3,5倍臨床劑量,既38.2 mg/kg→114.6 mg/kg→191 mg/kg按順序累計(jì)靜脈推注,AZM38.2mg/kg略微改變豚鼠在體心電圖各參數(shù),未有顯著性差異;AZM114.6mg/kg明顯改變豚鼠在體心電圖各參數(shù),并且AZM114.6mg/kg藥物組與對(duì)照組和AZM 38.2 mg/kg藥物組相比,具有顯著性差異。AZM 114.6 mg/kg能夠顯著降低心率,延長P-R間期和QTc間期,增大QRS波寬,降低QRS波和P波幅度;AZM 191 mg/kg,顯著降低心率,QRS波寬大變形,P波、T波消失。2.阿奇霉素注射液對(duì)豚鼠離體心臟心電圖的影響:結(jié)果顯示:阿奇霉素注射液1,5,10倍臨床濃度,按照41.5 mg/L → 207.5 mg/L→ 415 mg/L→Wash out的順序依次灌流,AZM 41.5 mg/L明顯降低心率,與對(duì)照組相比有顯著性差異;AZM207.5mg/L和AZM415mg/L明顯降低心率,延長P-R和QTc間期,增大QRS波寬,其中HR、P-R、QRS三指標(biāo)變化與對(duì)照組及低劑量組形成顯著性差異,QTc只與對(duì)照組形成顯著性差異;含鈣灌流液洗脫后,各指標(biāo)部分恢復(fù)。3.阿奇霉素注射液對(duì)豚鼠左心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響:不同濃度的AZM能夠不同程度的延長單個(gè)心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程(APD),且有一定的濃度依賴性;各濃度藥物組與對(duì)照組的APD50和APD90相比較,AZM830mg/L(20倍臨床濃度)組與對(duì)照組和AZM 41.5 mg/L(1倍臨床濃度)組有顯著性差異,而AZM 415 mg/L(10倍臨床濃度)組與對(duì)照組也形成顯著性差異。4.阿奇霉素注射液對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響:不同濃度的AZM能夠不同程度的延長單個(gè)心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程(APD),且有一定的濃度依賴性;各濃度藥物組與對(duì)照組的APD50和APD90相比較,只有AZM830 mg/L(20倍臨床濃度)組與對(duì)照組和AZM 41.5 mg/L(1倍臨床濃度)組有顯著性差異。5.阿奇霉素注射液對(duì)豚鼠左心室肌細(xì)胞L型鈣電流的影響:各濃度阿奇霉素都能明顯抑制L-型鈣通道,與低濃度組相比,各高濃度組對(duì)ICa-L的平均抑制率都具有顯著性差異(P0.05),AZM 1245 mg/L(30倍臨床濃度)組和AZM 2075 mg/L(50倍臨床濃度)組的抑制率都大于50%,故AZM抑制L型鈣電流的IC500小于1245 mg/L,為942.5±68.4 mg/L。6.阿奇霉素注射液對(duì)Na~+電流的影響:各濃度阿奇霉素都能明顯抑制鈉通道,與低濃度組相比,各高濃度組對(duì)INa的平均抑制率都具有顯著性差異(P0.05),AZM 1245 mg/L(30倍臨床濃度)和AZM 2075 mg/L(50倍臨床濃度)抑制率都大于50%,故AZM的對(duì)Na+電流的IC50小于1245mg/L,為1123.0±87.9 mg/L。7.阿奇霉素注射液對(duì)Ikr的影響:阿奇霉素不同濃度對(duì)正常豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的快速性延遲整流鉀電流(IKr)都有一定的抑制作用,且存在濃度依賴性,AZM為最大實(shí)驗(yàn)濃度2075 mg/L(50倍臨床濃度)時(shí),對(duì)Ikr的抑制率僅為31%左右,故AZM抑制Ikr的IC50大于50倍臨床濃度。結(jié)論:1.通過豚鼠在體ECG和離體ECG實(shí)驗(yàn),能夠初步證明阿奇霉素注射液的確能夠造成心動(dòng)過緩,穩(wěn)定誘發(fā)緩慢型心律失常。2.組織塊和單細(xì)胞動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)表明,AZM明顯延長APD50和APD90,使心臟復(fù)極延遲,進(jìn)一步驗(yàn)證了 AZM的致心律失常作用。3.離子通道實(shí)驗(yàn),阿奇霉素能夠不同程度阻滯L型鈣通道、鈉通道、快速延遲整流鉀電流通道,但AZM對(duì)ICa-L、INa抑制程度遠(yuǎn)大于IKr,AZM濃度由低到高的過程,抑制ICa-L、INa先于Ikr,這與心電圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。揭示AZM能誘導(dǎo)正常豚鼠發(fā)生房室傳導(dǎo)阻滯和心室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯,這可能與其明顯抑制鈉、鈣通道有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1330552