本文關(guān)鍵詞：膠類(lèi)中藥蛋白質(zhì)的分析及鑒定研究　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：膠類(lèi)中藥由動(dòng)物的皮、甲、骨、鱗或角等藥用部位經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間熬制等加工而成,主要具有補(bǔ)血、止血等功效。由于膠類(lèi)中藥需求量大,市面上偽品和摻偽品較多,如豬皮膠和雜皮膠等,因而成為近年來(lái)鑒定研究的熱點(diǎn)�！吨袊�(guó)藥典》中膠類(lèi)中藥的質(zhì)量控制體系雖然愈發(fā)完善,然而其專(zhuān)屬性鑒定的研究基礎(chǔ)仍然相對(duì)薄弱。因此,開(kāi)展相應(yīng)的基礎(chǔ)研究并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)膠類(lèi)中藥的準(zhǔn)確鑒別顯得十分急迫。本論文圍繞膠類(lèi)中藥及其基源動(dòng)物藥用部位中的蛋白質(zhì)開(kāi)展了分析研究,以期為膠類(lèi)中藥的鑒定提供依據(jù),并為膠類(lèi)中藥的補(bǔ)益活性物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容分為以下幾個(gè)部分:1.膠類(lèi)中藥蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與比較以水作為溶劑,料液比為1 100,85℃恒溫水浴加熱20 mins,制備膠類(lèi)中藥供試液,并采用Bradford和BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明,Bradford法(4.64%~12.74%)測(cè)定的膠類(lèi)中藥對(duì)照藥材的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)低于BCA法(35.82%~46.28%),提示精氨酸(Arg)和芳香性氨基酸(如Phe、Tyr、Trp)可能并不是組成膠類(lèi)中藥中蛋白質(zhì)的主要氨基酸。此外,不同批次的阿膠、龜甲膠和鹿角膠商品中蛋白質(zhì)的含量有一定差異;其中,阿膠蛋白質(zhì)含量與其對(duì)照藥材差異較小,而龜甲膠和鹿角膠的蛋白質(zhì)含量均高于相應(yīng)的對(duì)照藥材。2.膠類(lèi)中藥氨基酸及膠原蛋白的含量測(cè)定利用氨基酸分析儀測(cè)定膠類(lèi)中藥中17種氨基酸的含量。結(jié)果表明,膠類(lèi)中藥中氨基酸種類(lèi)和含量較為豐富;阿膠、龜甲膠、鹿角膠中氨基酸含量的高低順序基本一致,尤其是Gly和Pro的含量較高。主成分分析可知,Gly、Pro為三種膠類(lèi)中藥的共同特征氨基酸,表明其蛋白質(zhì)類(lèi)化學(xué)成分主要由膠原蛋白構(gòu)成。此外,聚類(lèi)分析顯示,市售膠類(lèi)中藥商品大致可被歸為三類(lèi)。然后,以柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定了膠類(lèi)中藥的L-Hyp,并以折算系數(shù)計(jì)算膠原蛋白的含量。結(jié)果表明,阿膠、龜甲膠和鹿角膠對(duì)照藥材的L-Hyp含量依次為9.11%、6.93%和8.06%,膠原蛋白含量為64.65%、76.92%和57.23%。18批膠類(lèi)中藥商品中L-Hyp和膠原蛋白的含量有一定差異;阿膠商品與對(duì)照藥材中兩者的含量較為接近,而鹿角膠和龜甲膠商品中兩者的含量均遠(yuǎn)高于對(duì)照藥材。3.基源動(dòng)物藥用部位及膠類(lèi)中藥中蛋白質(zhì)的電泳分析利用SDS-PAGE分析了膠原、基源動(dòng)物藥用部位和膠類(lèi)中藥的蛋白質(zhì)組成。結(jié)果表明,基源動(dòng)物藥用部位(驢皮、龜甲和鹿角脫盤(pán))含有豐富的蛋白質(zhì),且在10 k Da~250 k Da區(qū)間均有分布,而經(jīng)加工后得到的阿膠、龜甲膠和鹿角膠中蛋白質(zhì)均呈彌散分布,未見(jiàn)明顯條帶。三種膠類(lèi)中藥的SDS-PAGE及2-DE蛋白譜的主要差別在于:阿膠中蛋白質(zhì)的分子量范圍介于15 k Da~250 k Da,甚至更高,而鹿角膠和龜甲膠則基本上50 k Da,區(qū)域有所不同,可為膠類(lèi)中藥的鑒定提供一定參考。4.藥用部位蛋白質(zhì)在加工過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化基于電泳技術(shù)研究了藥用部位蛋白質(zhì)在加工過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明,經(jīng)短時(shí)間煎煮,驢皮、龜甲和鹿角脫盤(pán)中的蛋白質(zhì)能夠較快地被溶出,可能含有水溶性蛋白質(zhì)和鹽溶性蛋白質(zhì)。此后,隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)以及加入輔料(冰糖、黃酒和豆油),藥用部位中大分子的蛋白質(zhì)可能發(fā)生了較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化(如蛋白質(zhì)降解、聚合),泳道逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。5.胰蛋白酶消化—MALDI-TOF/TOF-MS分析膠類(lèi)中藥的多肽片段以SDS-PAGE分離得到的蛋白質(zhì)條帶為來(lái)源,經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)匹配檢索,從驢皮中鑒定出7個(gè)特征蛋白,從龜甲中鑒定出1個(gè)特征蛋白;以2-DE分離得到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為來(lái)源,經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)匹配檢索,從驢皮中鑒定出另外12個(gè)特征蛋白,從龜甲中鑒定出另外6個(gè)特征蛋白。此外,利用胰蛋白酶消化膠類(lèi)中藥蛋白質(zhì)(50~75 k Da及25 k Da上方),將所得到的多肽片段混合物以MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行分析,獲取了多肽片段的指紋圖譜,并從中選取了32個(gè)差異性多肽片段,以期為膠類(lèi)中藥的鑒定提供參考。6.膠原蛋白酶消化—Nano LC-Orbitrap MSD分析膠類(lèi)中藥的多肽片段以膠原蛋白酶分別消化阿膠、鹿角膠和龜甲膠的總蛋白質(zhì)得到肽段混合物,并利用Nano LC-Orbitrap MSD進(jìn)行分析,然后通過(guò)Mascot檢索和PEAKS軟件de novo sequencing解析了肽段的氨基酸序列,并從中發(fā)現(xiàn)了共計(jì)14個(gè)潛在特征性肽段,其中5個(gè)來(lái)源于阿膠,5個(gè)來(lái)源于龜甲膠,4個(gè)來(lái)源于鹿角膠。此外,將這些潛在特征性肽段導(dǎo)入BLAST在線分析并nrdb為依托,發(fā)現(xiàn)它們大部分來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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