本文關鍵詞：基于血清蛋白質組學技術研究刮痧干預腰椎間盤突出癥的效應機制

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【摘要】：目的:(1)運用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術,研究刮痧對腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation,LDH)模型大鼠血清炎性細胞因子的影響。(2)運用血清蛋白質組學技術,研究刮痧對LDH模型大鼠血清差異蛋白表達的影響,從整體角度研究刮痧干預LDH的作用機制。方法:(1)將72只雄性SD大鼠隨機分為模型組、假手術組、刮痧組,每組24只。模型組與刮痧組大鼠建立自體髓核移植非壓迫性LDH模型,假手術組同樣暴露右側L5DRG,切斷尾椎,但不做放置髓核處理。模型組與假手術組不予治療,刮痧組于造模后第5天開始干預,隔日刮一次,3次為一個療程,共刮3個療程。分別于造模后刮痧前、第1療程結束、第2療程結束、第3療程結束,共4個時間點觀察各組大鼠痛閾,并收集大鼠外周血。每組每次隨機取6只大鼠。ELISA檢測大鼠白細胞介素1β(IL-1β),白細胞介素4(IL-4),白細胞介素6(IL-6),干擾素γ(IFN-γ),腫瘤壞死因子α(TNF-α)。(2)收集LDH模型組與刮痧組大鼠部分血清樣本,分別為模型組1個療程、模型組2個療程、模型組3個療程、刮痧組1個療程、刮痧組2個療程、刮痧組3個療程,共6組,每組各6個樣本。運用iTRAQ技術,探究分別在3個療程中與刮痧干預相關的蛋白,進行包括分子功能、細胞組分與生物過程的GO(Gene Ontology)分析,運用IPA(Ingenuity(?)Pathway Analysis)數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的重要信號通路和相互作用的信號網(wǎng)絡。結果:(1)干預3個療程后,與模型組比較,刮痧能升高LDH大鼠熱痛閾值(P0.05),顯著降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α與IFN-γ水平(P0.05),而對IL-4水平無顯著影響(P0.05);IFN-γ/IL-4水平與大鼠熱痛閾值呈負相關,刮痧可明顯降低其水平。(2)①干預1個療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出198個差異蛋白。GO分析共鑒定出10個分子功能,13個細胞組分和19個生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結合(48%)、催化活性(22%)、分子功能調節(jié)(5%);在細胞組分中排名前三位的分別是細胞成分(28%)、細胞器(18%)、細胞器成分(14%);在生物過程中排名前三位的分別是細胞進程(19%)、生物調節(jié)(15%)、單生物過程(15%)。IPA分析共鑒定出306條信號通路,富集度較高的前10條信號通路分別為:FAK Signaling、Regulation of eIF4 and p70S6K Signaling、Actin Cytoskeleton Signaling、PI3K/AKT Signaling、Erythropoietin Signaling、IL-3 Signaling、LPS-stimulated MAPK Signaling、ERK/MAPK Signaling、Cancer Drug Resistance By Drug Efflux 和 Semaphorin Signaling in Neurons。差異蛋白主要涉及18個信號網(wǎng)絡。②干預2個療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出182個差異蛋白。GO分析共鑒定出11個分子功能,13個細胞組分和20個生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結合(44%)、催化活性(21%)、分子功能調節(jié)(9%);在細胞組分中排名前三位的分別是細胞成分(27%)、細胞器(18%)、細胞器成分(13%);在生物過程中排名前三位的分別是細胞進程(16%)、生物調節(jié)(15%)、單生物過程(14%)。IPA分析共鑒定出245條信號通路,富集度較高的前10條信號通路分別為:Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activation、Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、Actin Cytoskeleton Signaling、FXR/RXR Activation、Lanosterol Biosynthesis、Ubiquinol-10 Biosynthesis(Eukaryotic)、Rac Signaling、Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition Pathway 和Clathrin-mediated Endocytosis Signaling。差異蛋白主要涉及 13 個信號網(wǎng)絡。③干預3個療程后,刮痧組與模型組相比共鑒定出170個差異蛋白。GO分析共鑒定出10個分子功能,15個細胞組分和18個生物過程。在分子功能中排前三位的分別是結合(45%)、催化活性(25%)、分子功能調節(jié)(6%);在細胞組分中排名前三位的分別是細胞成分(27%)、細胞器(18%)、細胞器成分(13%);在生物過程中排名前三位的分別是細胞進程(20%)、生物調節(jié)(16%)、單生物過程(15%)。IPA分析共鑒定出245條信號通路,富集度較高的前10條信號通路分別為:LXR/RXRActivation、FXR/RXR Activation、5-aminoimidazole Ribonucleotide Biosynthesis I、Inhibition of Angiogenesis by TSP1、Melatonin Degradation II、tRNA Charging、Tetrahydrofolate Salvage from 5,10-methenyltetrahydrofolate、Tyrosine Degradation I、Serotonin Receptor Signaling 和Ceramide Biosynthesis。差異蛋白主要涉及13個信號網(wǎng)絡。結論:(1)刮痧能抑制自體髓核引起的LDH大鼠血清促炎因子,并抑制機體Thl免疫,使機體Thl/Th2免疫失衡恢復到正常狀態(tài),從而減輕其疼痛。(2)刮痧干預后,LDH大鼠血清中眾多蛋白的表達發(fā)生了改變,這些蛋白涉及眾多功能,說明機體發(fā)生了廣泛而復雜的變化。刮痧不僅可以調控與LDH相關的病理變化過程,亦可通過刺激生理變化過程達到治療效果。不同的蛋白可能先后激活不同的通路來誘導機體產生應答反應,起到治療效果,其中最主要的三條通路為:FAK Signaling、Acute Phase Response Signaling 和 LXR/RXR Activation。此外,刮痧可能通過調節(jié) ERK1/2、NFκB 等信號通路,從而參與了細胞形態(tài)與器官形態(tài)、機體損傷與異常、神經系統(tǒng)發(fā)育與功能等信號網(wǎng)絡。信號通路與網(wǎng)絡分析提示差異蛋白主要參與炎癥免疫、神經保護、維持細胞骨架動態(tài)平衡過程,Racl、Orml、Hpx、Gapdh、Hsp70、Htt等蛋白在這些過程中發(fā)揮了重要作用,可能作為潛在的靶點蛋白,為解釋刮痧治療LDH效應機制方面提供新的思路和依據(jù)。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R244.4

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