本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞中IL-6組蛋白乙�；{(diào)控及其在PQ所致肺纖維化中的作用

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【摘要】：研究背景與目的肺纖維化是一種慢性、進(jìn)行性的肺間質(zhì)的炎癥性疾病,其發(fā)生率為萬(wàn)分之一,自確診后五年生存率僅為30%-50%[1-3]。這一疾病的主要病理學(xué)改變是肺間質(zhì)中細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM extrace1lular matrix)過(guò)量沉積[2,4]。疾病發(fā)生機(jī)制尚不明確,但已有研究表明炎癥、上皮細(xì)胞的損傷、凋亡尤其是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT,epithelial-mesenchymal transition)可能在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用[5-8]。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程稱之為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,其特征性改變是細(xì)胞上皮特征的逐漸消失(例如:細(xì)胞間相互連接,較強(qiáng)的頂膜面-基底膜面極性),而間質(zhì)特性的愈益增強(qiáng)(例如:ECM復(fù)合物的產(chǎn)生、遷移和侵襲的能力)。另外,在EMT的過(guò)程中,間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物如α-SMA和波形蛋白都是高表達(dá)的,而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣黏素和細(xì)胞角蛋白卻是低表達(dá)的[6,9-11]。百草枯(PQ,paraquat)是一種劇毒除草劑,廣泛應(yīng)用于世界各地,注射PQ入體可以引起多種臟器尤其是肺臟的損傷,研究認(rèn)為PQ誘導(dǎo)的肺損傷包括急性期和慢性期改變,其急性期主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞損傷、肺水腫和炎癥;而慢性進(jìn)行性肺纖維化是非常嚴(yán)重的慢性肺損傷,死亡率高達(dá)25%-70%,通常在注射PQ數(shù)天至數(shù)周后發(fā)病[12]。然而,肺纖維化分子機(jī)制并不明確。白介素-6(IL-6,Interleukin 6)是一種多功能性細(xì)胞因子,通過(guò)不同信號(hào)通路參與多種自體免疫性疾病和慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。IL-6細(xì)胞來(lái)源廣泛,主要來(lái)源是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞[14,15]。巨噬細(xì)胞是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性組成部分之一,也是疾病過(guò)程中炎癥反應(yīng)的主導(dǎo)調(diào)節(jié)因素,巨噬細(xì)胞釋放的IL-6進(jìn)入細(xì)胞間隙后可通過(guò)旁分泌的方式影響纖維化進(jìn)程和炎癥反應(yīng)。IL-6通過(guò)IL-6受體和gp130來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)活性,IL-6與IL-6膜結(jié)合型受體結(jié)合后激活gp130二聚體,三者共同組成具有高親和力的功能型復(fù)合物。功能型復(fù)合物激活JAKs(Janus kinases)從而激動(dòng)gp130酪氨酸759來(lái)源的SHP-2/ERKMAPK信號(hào)通路和gp130 YXXQ介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)通路[16],使IL-6具備同時(shí)發(fā)揮兩種不同甚至相對(duì)立功能的能力,而IL-6最終的功能趨向可能是多種信號(hào)通路共同作用的結(jié)果[17]。IL-6能夠促進(jìn)膠原纖維沉積于多種器官,例如腎臟、心臟以及皮膚等[18],研究報(bào)道IL-6在發(fā)生肺纖維化的人以及小鼠體內(nèi)高表達(dá)[17,19-23],但是,IL-6在纖維化中的作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍亟待探究。表觀遺傳學(xué)是研究基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)可遺傳變化的一門分支學(xué)科。組蛋白修飾(組蛋白乙�；�、甲基化、磷酸化、脫氨基化、β-N-乙酰葡糖胺、ADP核糖基化、泛素化和蘇素化等)作為其研究對(duì)象之一,通過(guò)影響組蛋白與DNA的親和性來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。組蛋白乙�；亲畛Ｒ姷慕M蛋白修飾,主要通過(guò)組蛋白乙�；�(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)達(dá)到修飾目的。研究報(bào)道組蛋白乙�；谘装Y反應(yīng)、纖維化和PQ所致帕金森模型中發(fā)揮作用,由此,我們猜想組蛋白乙�；赑Q所致肺纖維化和急性炎癥中是否具有調(diào)控作用以及如何發(fā)揮調(diào)控作用?CRISPR-ON是一種RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng),是新型、高效誘導(dǎo)特定基因表達(dá)的基因編輯系統(tǒng)[24,25]。CRISPR-ON由三部分組成:Cas9-VP64,sgRNA和MS2-P65-HSF1,三者共同形成蛋白復(fù)合物-協(xié)同激活介質(zhì)(SAM),能高效激活同一細(xì)胞單個(gè)或多達(dá)10個(gè)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄[26]。本課題以CRISPR-ON為探索調(diào)劑機(jī)制的一種重要手段,探究PQ肺纖維化中可能的調(diào)控機(jī)制。因此,本研究的主要目的是明確IL-6在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中的作用,同時(shí)探究表觀遺傳在IL-6轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。第一部分:IL-6在PQ肺纖維化中的作用研究方法:1.構(gòu)建并驗(yàn)證PQ中毒的動(dòng)物模型。2.通過(guò)檢測(cè)mRNA及蛋白表達(dá)的方法從PQ動(dòng)物模型中篩選出表達(dá)異常的基因。3.通過(guò)對(duì)細(xì)胞系的篩選確定升高表達(dá)的IL-6的來(lái)源。4.阻斷IL-6信號(hào)通路以明確IL-6在PQ肺纖維化中的作用。5.通過(guò)巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探究IL-6在肺纖維化中的作用機(jī)制。結(jié)果:1.C57BL/6小鼠腹腔注射PQ10mg/kg 48h和1month構(gòu)建PQ中毒的急、慢性動(dòng)物模型,使用HE染色和MASSON染色驗(yàn)證了模型構(gòu)建成功。2.提取動(dòng)物模型肺組織RNA并采用qPCR篩選了 IL-6、IL-1β、IL-8、COX-2、MMP9、TnF-α和VCAM1等炎癥及其相關(guān)細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)IL-6在動(dòng)物模型中呈PQ劑量依賴性增高,同時(shí)蛋白檢測(cè)結(jié)果和mRNA的結(jié)果一致。3.使用PQ處理HLF、16HBE和BMDM發(fā)現(xiàn)IL-6只在BMDM中呈時(shí)間依賴性和劑量依賴的升高。4.小鼠腹腔注射IL-6受體抑制劑Gp130Fc和PQ后檢測(cè)小鼠肺纖維化的程度,發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)基因在單獨(dú)注射PQ的小鼠肺臟中表達(dá)高于對(duì)照組,而在給予Gp130Fc的小鼠肺臟中表達(dá)降低。同時(shí),MASSON染色也證實(shí)了 Gp130Fc可以減輕肺纖維。另外,在3T3細(xì)胞中給予重組IL-6后纖維化相關(guān)基因變化無(wú)明顯變化,排除了 IL-6直接影響纖維細(xì)胞的作用方式。5.通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞中EMT相關(guān)基因在給予PQ處理的BMDM裂解液后高表達(dá),而同時(shí)給予Gp130Fc后表達(dá)降低。由此證明了BMDM分泌的IL-6通過(guò)促進(jìn)EMT在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。結(jié)論:我們成功構(gòu)建PQ肺損傷的急性肺炎癥模型和慢性肺纖維化的模型,在動(dòng)物模型中篩選多種細(xì)胞因子,并通過(guò)一系列的研究手段確定并驗(yàn)證了 IL-6在肺纖維化中的重要作用。此外,在對(duì)PQ肺纖維化中IL-6高表達(dá)的深入研究發(fā)現(xiàn),IL-6通過(guò)EMT促進(jìn)PQ肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。第二部分:IL-6在PQ肺纖維化中調(diào)節(jié)機(jī)制的研究方法:1.在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中給予HDAC抑制劑和HAT抑制劑后,檢測(cè)IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)以探究組蛋白乙�；瘜�(duì)于IL-6表達(dá)的影響。2.在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中給予HDAC抑制劑和HAT抑制劑后,檢測(cè)組蛋白乙�；瘜�(duì)PQ所致肺損傷的影響。3.通過(guò)檢測(cè)HDAC各亞型的表達(dá)進(jìn)一步明確HDACs在PQ所致肺纖維化中的重要作用。4.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、CRISPR-ON和ChIP實(shí)驗(yàn)探究IL-6的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1.通過(guò)qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6受組蛋白乙�；{(diào)控。2.通過(guò)HE染色、MASSON染色、免疫熒光、qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組蛋白乙�；瘜�(duì)PQ肺損傷和EMT相關(guān)基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。3.經(jīng)qPCR檢測(cè),HDAC3在PQ處理的肺組織和BMDM中的呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性降低。4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示VPA增強(qiáng)IL-6啟動(dòng)子區(qū)活性,CRISPR-ON技術(shù)證實(shí)VPA、Anacardic acid分別促進(jìn)和抑制IL-6的轉(zhuǎn)錄,另外,ChIP-qPCR技術(shù)也驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞中IL-6啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳改變。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-6在PQ處理的肺組織和BMDM中的表達(dá)受組蛋白乙�；恼{(diào)控,同時(shí)HAT抑制劑能夠減輕PQ肺纖維化。隨后,我們?cè)隗w內(nèi)、體外檢測(cè)HDAC各亞型的表達(dá)發(fā)現(xiàn)HDAC3呈PQ劑量依賴性和時(shí)間依賴性的降低,此結(jié)果和IL-6的表達(dá)趨勢(shì)恰好相反,于是我們推測(cè)IL-6的表達(dá)可能主要由HDAC3調(diào)控。最后,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、CRISPR-ON以及ChIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-6啟動(dòng)子區(qū)受到組蛋白乙酰化的調(diào)控。小結(jié)研究報(bào)道高表達(dá)的IL-6在纖維化疾病中具有作用,但I(xiàn)L-6在其中的作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究的首要目的是明確IL-6在PQ介導(dǎo)的肺纖維化中的作用并探究表觀遺傳是否參與IL-6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們構(gòu)建了 PQ中毒的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)在處理組小鼠的肺臟及細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性增高。同時(shí),研究結(jié)果表明IL-6是通過(guò)增強(qiáng)EMT促進(jìn)PQ肺纖維化發(fā)生發(fā)展的。另外,IL-6在肺纖維化中的表達(dá)和功能受表觀遺傳調(diào)控,首先,HDAC抑制劑促進(jìn)IL-6在肺纖維化中的表達(dá),HAT抑制劑抑制IL-6表達(dá);其次,CRISPR-ON促進(jìn)IL-6轉(zhuǎn)錄的作用受到HDAC抑制劑的增強(qiáng)和HAT抑制劑的減弱;最后,我們通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑增強(qiáng)IL-6啟動(dòng)子區(qū)組蛋白激活標(biāo)記物H3K4me3和H3K9ac表達(dá)。綜上,IL-6通過(guò)EMT在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)揮作用并且在體內(nèi)、外都受到組蛋白乙�；{(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563

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