本文關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌作用機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:評價(jià)牛貝消核驗(yàn)方治療結(jié)核病的臨床療效;了解結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基中的生長規(guī)律和牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響;研究牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響,確定牛貝消核作用的關(guān)鍵蛋白,闡明牛貝消核提取物抗結(jié)核的作用機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核藥物靶標(biāo)和新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.牛貝消核驗(yàn)方治療結(jié)核病的臨床療效評價(jià)。對1998年～2012年就診于四川省內(nèi)江仁愛醫(yī)院傳染科和內(nèi)江陳氏診所的90例結(jié)核病患者的臨床資料進(jìn)行回顧性研究。2.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響。在接種有結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基中加入蒸餾水為陰性對照組,加入異煙肼為陽性對照組,加入牛貝消核提取物為實(shí)驗(yàn)組,每隔7天取100μL培養(yǎng)物,10倍梯度稀釋,涂板,培養(yǎng)3-4周菌落計(jì)數(shù)(CFU),繪制細(xì)菌生長曲線。3.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響。在培養(yǎng)至對數(shù)期的結(jié)核菌Middle brook7H9液體培養(yǎng)物中,加入蒸餾水為陰性對照組,加入異煙肼為陽性對照組,加入牛貝消核提取物為實(shí)驗(yàn)組,分別于加入藥物前以及加入藥物后6h和7d取出培養(yǎng)物,應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)比較分析牛貝消核提取物作用前后結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白表達(dá)譜的差異。結(jié)果:1.牛貝消核驗(yàn)方治療結(jié)核病的臨床療效評價(jià):治療1～2個(gè)療程后,湯劑組83例患者中治愈46例(55.42%),顯效29例(34.94%),有效6例(7.23%),無效2例(2.41%),總有效率97.59%;散劑組7例患者中,治愈5例(71.43%),顯效2例(28.57%),總有效率I00%。2.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響:培養(yǎng)28天后陰性對照組菌落數(shù)增多[(CFUs/ml)Log=5.93±0.11],INH組菌落數(shù)為0,牛貝消核提取物組菌落數(shù)減少[(CFUs/ml)Log10=4.31±1.09],各組間有顯著性差異(P=0.0118,0.01P0.05)。3.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響:與陰性對照組相比,牛貝消核提取物組有142個(gè)差異蛋白斑點(diǎn),INH組有147個(gè)差異蛋白斑點(diǎn),合計(jì)149個(gè);選取其中的71個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,得到41個(gè)高可信度蛋白,其中INH組有35個(gè)(7個(gè)上調(diào),28個(gè)下調(diào)),牛貝消核提取物組有39個(gè)(5個(gè)上調(diào),34個(gè)下調(diào)),兩組共同差異蛋白為33個(gè)。分析其生物學(xué)功能,可知:參與免疫反應(yīng)的有免疫蛋白MPT64(immunogenicproteinMPT64)、角質(zhì)酶培養(yǎng)濾液蛋白21(CFP21)、富于丙氨酸和脯氨酸的分泌蛋白 Apa(alanine and proline-rich secreted protein Apa);參與蛋白合成的有 50S 核糖體蛋白 L7/L12(50S ribosomal protein L7/L12)、30S 核糖體蛋白 S1(30S ribosomal protein S1)、觸發(fā)因子(trigger factor)、分子伴侶 GroEL(molecular chaperone GroEL)、熱休克蛋白X(heat shock protein hspX);參與能量代謝的蛋白有:磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceromutase)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase)、磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)、轉(zhuǎn)醇醛酶(transaldolase)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 IIA(glucose transporter subunit IIA)和糖原累積調(diào)節(jié)蛋白 GarA(glycogen accumulation regulator GarA);參與抗氧化應(yīng)激的蛋白有:2-半胱氨酸過氧化物還原酶(2-Cys peroxiredoxin)、硫氧還蛋白(thioredoxin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和DNA饑餓/固定相保護(hù)蛋白(DNA starvation/stationary phase protection protein,Dsp);參與氨基酸合成的蛋白有:磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase)、γ-谷氨酰磷酸還原酶(gamma-glutamyl phosphate reductase)和 4-輕基-tetrahydrodipicolinate 還原酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase);與細(xì)菌的應(yīng)激力有關(guān)的蛋白有:熱休克蛋白X(heatshockproteinhspX)和普遍應(yīng)激蛋白家族(Universal stress protein family)。其中抗氧化應(yīng)激、糖酵解和熱休克蛋白等與結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染有關(guān)。結(jié)論:1.牛貝消核復(fù)方湯劑和散劑治療結(jié)核病療效顯著。2.1mg/ml的牛貝消核提取物能抑制結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的生長。3.牛貝消核提取物可通過抑制結(jié)核分枝桿菌的蛋白合成、能量代謝、抗氧化應(yīng)激,減弱結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的生存能力,影響其潛伏感染,從而發(fā)揮抗結(jié)核作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R259

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本文編號：1289481