本文關(guān)鍵詞：外源性HMGB1對(duì)放療后殘存人胰腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用研究

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【摘要】：研究目的探究外源性高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)對(duì)放療后殘存人胰腺癌細(xì)胞系(SW1990、PANC-1)增殖和轉(zhuǎn)移的影響,并補(bǔ)充研究了外源性HMGB1對(duì)放療后裸鼠皮下瘤增殖的影響,初步探究外源性HMGB1引起放療后殘存胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。研究方法(1)ELISA實(shí)驗(yàn):將胰腺癌SW1990、PANC-1細(xì)胞分別接種于24孔板中,平均每孔1×105個(gè)細(xì)胞,每孔培養(yǎng)基定量至800μl,共10塊板,待細(xì)胞貼壁后分別將實(shí)驗(yàn)設(shè)置:0Gy,4Gy,8Gy,10Gy以及12Gy共5組不同放療劑量。然后分別對(duì)10塊板給予相應(yīng)的放療劑量,繼續(xù)培養(yǎng)24h后依次將0Gy,4Gy,8Gy,10Gy及12Gy 5組不同放射劑量的細(xì)胞上清提取出來,后通過ELISA檢測(cè)法對(duì)不同放療劑量下細(xì)胞上清中HMGB1的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。(2)光學(xué)顯微鏡拍照:將胰腺癌SW1990、PANC-1細(xì)胞分別接種于24孔板中,大概每孔約1×105個(gè)細(xì)胞,共種4塊24孔板,待胰腺癌SW1990細(xì)胞貼壁后分為2組:0Gy及10Gy放射劑量進(jìn)行照射;而胰腺癌Panc-1細(xì)胞貼壁后分為2組:0Gy及4Gy放射劑量進(jìn)行照射。待放療結(jié)束后繼續(xù)將胰腺癌細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h,然后對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行換液后,采用光學(xué)顯微鏡(Optical Microscope,OM)分別對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行圖像采集。(3)劃痕實(shí)驗(yàn):將收集獲得的放療后殘存的胰腺癌SW1990、PANC-1細(xì)胞系分別接種于24孔板中,計(jì)數(shù)細(xì)胞約1.5×105細(xì)胞/孔,共6塊板,待放療后殘存細(xì)胞鋪滿整孔后進(jìn)行劃痕,然后用PBS沖洗3遍后,將實(shí)驗(yàn)分為三組:對(duì)照組(添加無血清培養(yǎng)基)、HMGB1組(添加含有100ng/m L HMGB1的無血清培養(yǎng)基)及HMGB1+EP組(添加含有100ng/m L HMGB1+100μmol EP的無血清培養(yǎng)基),共500μl培養(yǎng)基/孔,最后在光學(xué)顯微鏡下分別在0h,12h,24h時(shí)間點(diǎn)對(duì)2株細(xì)胞分別進(jìn)行取樣拍照。(4)CFSE實(shí)驗(yàn):將收集獲得的放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞懸液及放療后殘存胰腺癌Panc-1細(xì)胞懸液并分別種于9塊培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待放療后殘存胰腺癌細(xì)胞貼壁后,將實(shí)驗(yàn)共分為三組:對(duì)照組,HMGB1組及HMGB1+EP組。其中對(duì)照組在經(jīng)過換液后添加3m L DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);HMGB1組在經(jīng)過換液后添加3m L含100ng/m L HMGB1的DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);而HMGB1+EP組經(jīng)過換液后添加3m L含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待3組培養(yǎng)皿于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h后拿出進(jìn)行處理,采用CFSE法分析三組處理對(duì)放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞及放療后殘存胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響。(5)蛋白質(zhì)印記法(Western Blotting,WB)檢測(cè):將收集獲得的放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞懸液及放療后殘存胰腺癌Panc-1細(xì)胞懸液并分別種于2個(gè)培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待放療后殘存胰腺癌細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)分為兩組:對(duì)照組及HMGB1組。對(duì)照組殘存胰腺癌細(xì)胞大皿經(jīng)換液加入3m L有血清培養(yǎng)基;HMGB1組殘存胰腺癌細(xì)胞大皿經(jīng)換液后加入3m L含100ng/m L HMGB1的有血清培養(yǎng)基。將4組培養(yǎng)皿放置在恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h后取出,分別提蛋白;通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)通路蛋白GSK-3β、p-GSK,轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-CA、N-CA,增殖相關(guān)蛋白Ki67以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。(6)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將胰腺癌SW1990細(xì)胞接種于9個(gè)培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待細(xì)胞融合度接近100%時(shí)將細(xì)胞消化離心至無菌EP管中,然后取200μl細(xì)胞懸液注射入裸鼠皮下,從而建立裸鼠胰腺癌皮下瘤模型,待模型建好后,同時(shí)將9只裸鼠進(jìn)行放療,放療劑量為10Gy,隔日放療,連續(xù)3次,放療周期結(jié)束后,將9只裸鼠共分為三組:對(duì)照組3只、HMGB1組3只及HMGB1+EP組3只。其中對(duì)照組是向裸鼠皮下瘤四周注射0.9%的生理鹽水,約200μl;HMGB1組向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1的生理鹽水,約200μl;HMGB1+EP組向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的生理鹽水,約200μl。在實(shí)驗(yàn)過程中相隔2天用直尺測(cè)定皮下瘤的長(zhǎng)徑及寬徑,從而利用公式計(jì)算皮下瘤的體積,最后并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。研究結(jié)果(1)不同放療劑量(4Gy,8Gy,10Gy及12Gy)分別處理胰腺癌SW1990、Panc-1細(xì)胞后放療后上清中HMGB1的含量均較對(duì)照組(0Gy)增高;且放療劑量為4Gy時(shí)胰腺癌Panc-1細(xì)胞系培養(yǎng)上清中HMGB1含量最高,而放療劑量為10Gy時(shí)胰腺癌SW1990細(xì)胞系培養(yǎng)上清中HMGB1含量最高。(2)在正常無放療上清培養(yǎng)條件下,SW1990、PANC-1呈小梭形生長(zhǎng);在對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞進(jìn)行4Gy放射治療以及對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞進(jìn)行10Gy放射治療后,繼續(xù)在放療上清培養(yǎng)條件下培養(yǎng),Panc-1及SW1990細(xì)胞均變大且觸角增多,細(xì)胞生長(zhǎng)速度均變快。(3)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HMGB1組放療后殘存胰腺癌細(xì)胞的遷移距離及遷移面積均較對(duì)照組及HMGB1+EP組明顯增加,而HMGB1+EP(HMGB1抑制劑)組放療后殘存胰腺癌細(xì)胞的遷移距離及遷移面積則較對(duì)照組明顯縮小。(4)CFSE結(jié)果顯示對(duì)照組、HMGB1組及HMGB1+EP組殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖率分別為:(43.6±2.1)%,(62.5±2.1)%及(33.2±1.7)%,殘存胰腺癌Panc-1細(xì)胞三組增殖率分別為:(37.5±0.9)%,(49±1.4)%及(29.3±1.3)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HMGB1組的細(xì)胞增殖率明顯高于其他兩組,且HMGB1+EP組的增殖率則較對(duì)照組降低。(5)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HMGB1組放療后殘存胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)降低及N-cadherin表達(dá)增高;增殖相關(guān)蛋白Ki67及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增高;且GSK-3β被激活,活化的p-GSK表達(dá)亦增高。(6)三組實(shí)驗(yàn)分別在放療后的種植瘤周圍皮下注射200μl 0.9%生理鹽水,200μl HMGB1及200μl HMGB1+EP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤周注射含有EP(HMGB1抑制劑)的瘤體體積較對(duì)照組減小,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論放療可以使HMGB1在放療上清中的表達(dá)增高,而外源性HMGB1可以促進(jìn)放療后殘存人胰腺癌SW1990、Panc-1細(xì)胞增殖和遷移。外源性HMGB1上調(diào)Ki67、N-CA、p-GSK及Bcl-2的表達(dá)水平,下調(diào)E-CA的表達(dá)水平。外源性HMGB1抑制劑可抑制放療后裸鼠皮下瘤的增殖。外源性HMGB1可以促進(jìn)放療后殘存人胰腺癌SW1990、PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與Wnt通路的激活及EMT的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 白雪莉;馬濤;梁廷波;;2016年NCCN胰腺癌臨床實(shí)踐指南(V1版)更新內(nèi)容解讀[J];中國(guó)實(shí)用外科雜志;2016年08期

2 項(xiàng)金峰;施思;梁丁孔;虞先o，

本文編號(hào)：1276323