本文關鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細胞過程中microRNA介導的NF-κB信號通路調(diào)節(jié)

  更多相關文章： 人骨髓間充質(zhì)干細胞 汗腺細胞 誘導分化 microRNA NF-κB信號通路

【摘要】：目的：前期,我們實驗室已經(jīng)確證了建立一定的共培養(yǎng)條件可以誘導間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細胞。但其中關鍵的基礎科學問題并沒有完全解決,本研究的主要目的是,利用microRNA新技術(shù),尋找MSCs分化為汗腺樣細胞過程中的關鍵microRNA及其介導的信號通路調(diào)控,并驗證microRNA細胞生物功能。方法：前期研究表明,EDA-A1能促進正常和外胚層發(fā)育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚層組織器官的發(fā)育,EGF能提高MSCs分化為SGLCs的誘導率。因此,本文采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EGF以及汗腺熱休克損傷微環(huán)境,通過transwell間接培養(yǎng)板,誘導MSCs分化為SGLCs。然后通過microRNA基因芯片檢測,分析MSCs誘導前后,以及正常汗腺的microRNA差異表達譜,其中發(fā)生極其顯著改變的microRNAs被篩選出來,通過生物信息學進行靶點預測,其中直接靶向與汗腺發(fā)育、干細胞分化相關基因的microRNAs:has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p被進一步篩選出來。利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別將synthetic has-miR-138-5p mimics (inhibitor)-cy3、synthetic has-miR-146a-5p mimics (inhibitor)-cy3和synthetic microRNA mimics (inhibitor) negative control-cy3轉(zhuǎn)染MSCs,進行靶基因驗證,分析其參與的信號通路網(wǎng)絡,并進一步驗證其生物功能。結(jié)果：通過間接誘導模型,誘導10d后,transwell培養(yǎng)板上層的MSCs,部分形態(tài)由“長梭形”變?yōu)椤安灰?guī)則橢圓形或多邊形”,局部呈現(xiàn)“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。進行免疫熒光檢測,結(jié)果顯示大部分誘導后的細胞CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表達陽性,說明部分細胞經(jīng)誘導后表型轉(zhuǎn)換為汗腺樣細胞。MicroRNA表達譜的差異比對結(jié)果顯示,SGLCs VS MSCs,19 microRNAs上調(diào),49 microRNAs下調(diào);SGCs VS MSCs,120 microRNAs上調(diào),59 microRNAs下調(diào)。為了縮小研究范圍,我們?nèi)GLCs VS MSCs和SGCs VS MSCs的交集,結(jié)果37 microRNAs在以上兩個比對中均出現(xiàn),其中12 microRNAs上調(diào),25 microRNAs下調(diào)。通過生物信息學靶點預測,我們發(fā)現(xiàn)該37個microRNAs：與汗腺發(fā)育和干細包分化的一系列因子相關,例如靶向細胞因子CEA、KRT、EDA以及參與信號通路EDA/EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等的調(diào)節(jié)。其中has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p.均直接靶向NE-κB信號通路相關的多個基因。MicroRNAs轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后,熒光顯微鏡下觀察,大部分細胞胞漿顯示飽和的紅色熒光,流式結(jié)果亦顯示轉(zhuǎn)染效率為98.56%. RT-PCR結(jié)果顯示,has-miR-138-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后,h-KRT19、h-NFKB1、h-RELA和h-RELB的表達顯著增高,但轉(zhuǎn)染前后均不表達h-KRT16, has-miR-138-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后,h-NFKB1、h-RELA和h-RELB表達顯著降低。另,has-miR-146a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達增高,has-miR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達降低。報道顯示,miR-146是NF-kB通路的負反饋調(diào)節(jié)者,表達miR-146a的細胞,其IκBα的絲氨酸32位置的磷酸化將降低至～40%。因此,我們推斷,MSCs誘導過程中,has-miR-138-5p減少,導致其調(diào)節(jié)的靶基因h-NFKB1、h-RELA、h-RELB表達增加,從而激活NF-κB信號通路,這時,作為一個負反饋調(diào)節(jié)機制,has-miR-146a-5p表達增加,導致h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達降低,從而從上游調(diào)節(jié)和抑制NF-κB的活化。結(jié)論：在MSCs誘導分化成SGLCs過程中,has-miR-138-5p下調(diào)激活NF-κB通路,has-miR-146a-5p上調(diào),負反饋抑制NF-κB活化,兩者形成NF-κB正負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。MicroRNAs介導的NF-κB信號通路調(diào)節(jié)是誘導MSCs分化成SGLCs的關鍵分子機制之一。
【關鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細胞 汗腺細胞 誘導分化 microRNA NF-κB信號通路
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 英文縮略表7-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-18
• 一 人骨髓間充質(zhì)干細胞和人皮膚汗腺細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定18-34
• 1. 材料18-23
• 1.1 主要試劑18-19
• 1.2 主要儀器19-20
• 1.3 試劑配制20-23
• 1.4 標本來源23
• 2. 方法23-28
• 2.1 人MSCs的傳代培養(yǎng)、分化功能鑒定23-26
• 2.2 人SGCs的分離、純化、培養(yǎng)和抗原表達26-28
• 3. 結(jié)果28-32
• 3.1 人MSCs的分離與培養(yǎng)28
• 3.2 人SGCs的分離、培養(yǎng)與純化28-31
• 3.3 人MSCs誘導分化功能31-32
• 3.4 人SGCs的抗原表達的鑒定32
• 4. 討論32-34
• 二 人骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為汗腺樣細胞34-45
• 1. 材料34
• 1.1 主要試劑34
• 1.2 主要儀器34
• 1.3 試劑配制34
• 1.4 標本來源34
• 2. 方法34-36
• 2.1 人骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為汗腺樣細胞的培養(yǎng)模型構(gòu)建34-35
• 2.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞與人皮膚汗腺細胞共培養(yǎng)前后細胞表型的鑒定35-36
• 3. 結(jié)果36-43
• 3.1 人骨髓間充質(zhì)干細胞與人皮膚汗腺細胞共培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)的變化36-38
• 3.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為汗腺樣細胞過程中細胞表型的轉(zhuǎn)變38-43
• 4. 討論43-45
• 三 MSCs誘導前后及汗腺組織的microRNA表達譜實驗及結(jié)果分析45-60
• 1. 材料45-46
• 1.1 主要試劑45
• 1.2 主要儀器45-46
• 1.3 標本來源46
• 2. 方法46-52
• 2.1 MicroRNA芯片檢測樣本制備46-47
• 2.2 Affymetrix microRNA表達譜芯片檢測47-52
• 3. 結(jié)果52-57
• 3.1 MicroRNA聚類分析和散點圖52-54
• 3.2 MicroRNA數(shù)據(jù)比對分析54-57
• 4. 討論57-60
• 第四部分 MicroRNA作用靶點和參與NF-κB信號通路調(diào)節(jié)的研究60-80
• 1. 材料60-61
• 1.1 主要試劑60
• 1.2 主要儀器60-61
• 2. 方法61-68
• 2.1 與汗腺發(fā)育相關的microRNAs及其靶點分析61-62
• 2.2 Has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p轉(zhuǎn)染MSCs62-63
• 2.3 Has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p的靶點檢測63-67
• 2.4 細胞免疫化學染色67-68
• 3. 結(jié)果68-78
• 3.1 與汗腺發(fā)育相關的microRNAs及其靶點分析68-70
• 3.2 Hsa-miR-138-5p和hsa-miR-146a-5p轉(zhuǎn)染MSCs結(jié)果分析70-72
• 3.3 驗證hsa-miR-138-5p和hsa-miR-146a-5p作用靶點72-76
• 3.4 Hsa-miR-138-5p誘導MSCs分化為SGLCs生物功能鑒定76-78
• 4. 討論78-80
• 總結(jié)80-82
• 參考文獻82-86
• 文獻綜述86-112
• 參考文獻102-112
• 攻讀博士學位期間發(fā)表論文及參與科研情況112-113
• 致謝113

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：990936