發(fā)布時間：2017-10-06 12:12

  本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細胞促進血管內(nèi)皮細胞功能活性的機制研究

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【摘要】：目的：通過研究脂肪間充質(zhì)干細胞增強血管內(nèi)皮細胞的功能活性,進一步明確脂肪間充質(zhì)干細胞促進血管生成的生物學效應(yīng),進而驗證和了解脂肪間充質(zhì)干細胞對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用的分子機制，探討AD-MSCs促進HUVECs發(fā)揮功能活性的途徑,為進一步研究脂肪間充質(zhì)干細胞及無細胞治療體系在臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：第一部分細胞分離培養(yǎng)與鑒定①分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞脂肪組織來自健康女性吸脂者,經(jīng)組織標本所屬人知情。②用誘導(dǎo)液對分離培養(yǎng)的脂肪來源干細胞進行鑒定。誘導(dǎo)其向脂肪細胞及骨細胞方向分化,分別用油紅0和茜素紅-S檢測其向成脂和成骨分化。③通過流式細胞儀明確人臍靜脈內(nèi)皮細胞CD31陽性細胞的百分比。第二部分選取第3-6代生長狀態(tài)良好的脂肪間充質(zhì)干細胞,由原來含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液,過夜收集其上清液,離心后加入3%和5%的FBS備用。用含相應(yīng)濃度FBS的DMEM設(shè)立正常對照組,分別進行內(nèi)皮細胞的增殖實驗、劃痕實驗、Matrigel成管實驗、Matrigel三維培養(yǎng)的出茅實驗。計數(shù)統(tǒng)計表示用均數(shù)±標準差(x±SD)差表示,第三部分分子機制研究①用雙抗體夾心ELISA去檢測收集上清液VEGF濃度；②在Transwell體系間接共培養(yǎng),觀察HUVEC在AD-MSCs的誘導(dǎo)下遷移。③用雙抗體夾心ELISA法測定Transwell培養(yǎng)體系中VEGF濃度水平；④分析培養(yǎng)體系中AD-MSCs與HUVECs分泌VEGF勺差異性。⑤提取相應(yīng)HUVECs的總蛋白和總RNA。進行、Vestern blot檢測，測定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表達；⑥以提取的RNA為模板,轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進一步進行Real-time PCR,檢測HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表達水平。結(jié)果：第一部分.①人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)和AD-MSCs在10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液流式鑒定培養(yǎng)下生長良好。②培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞細胞免疫組織化學CD31陽性,定位于細胞膜。③FCM結(jié)果顯示,CD31陽性細胞數(shù)占檢測總數(shù)的98.3%,CD34陽性細胞僅占檢測總數(shù)的0.016%。④脂肪間充質(zhì)干細胞能定向誘導(dǎo)成脂肪細胞即骨細胞，油紅O和茜素紅S檢測陽性。第二部分①CCK-8細胞增殖活力檢測 用MSC-CM處理的HUVECs 24小時與對照組P值0.01,兩者具有顯著的統(tǒng)計學意義。培養(yǎng)36小時后,P值0.05,兩者有統(tǒng)計學意義。②劃痕實驗MSC-CM組在前六小時的遷移速率就高于Control組。至12小時，，MSC-CM組細胞侵入面積已達42%,而對照組僅為10%左右。③管腔形成實驗中,實驗組節(jié)點數(shù)平均為21個/視野,而對照組為12個/視野,成組T檢驗得知P0.001,具有極其顯著的統(tǒng)計學意義。④出芽實驗亦顯示,實驗組與Control組P=0.004,兩者具有極顯著的統(tǒng)計學意義。第三部分①脂肪間充質(zhì)干細胞上清的VEGF濃度與臍靜脈內(nèi)皮細胞上清中VEGF的濃度兩者具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)。遷移實驗②Transwells誘導(dǎo)組與對AD-MSC照組兩者具有極其顯著的統(tǒng)計學意義(P0.001)。③來自組的上清液中AD-MSCs濃度為26.87±2.7VEGF而7pg/mL,組則僅為7.65±1.2Vehicle(表3-6),兩者有極其顯3pg/mL著的統(tǒng)計學意義(P0.001)。④每1×104個細胞為單位,與HUCVEC-CM之間MS C-CM比較分泌的量有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01)：⑤經(jīng)MSC-CM處理的VRGF其表達HUVECs,蛋白的相對表達量均上調(diào),⑥VEGF、HIF-1α及Cdk5Rap3結(jié)果相與Western Blot似，各自的表達均有增加。nRNA結(jié)論：可以促進AD-MSCs的生物學增殖、遷移、管腔結(jié)構(gòu)形成效應(yīng),其外HUVECs在通過分泌等促進VEGF的功能活性,內(nèi)在通過調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白分子VEGF、H1F-1αHUVECs及3表達。CDK5RAP
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 血管化 內(nèi)皮細胞 血管內(nèi)皮生長因子 逆轉(zhuǎn)錄
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-16
• 第一部分 臍靜脈內(nèi)皮細胞及脂肪間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與鑒定16-29
• 材料16-18
• 方法18-22
• 結(jié)果22-26
• 討論26-29
• 第二部分 脂肪間充質(zhì)干細胞促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成效應(yīng)29-43
• 材料29-31
• 方法31-35
• 結(jié)果35-39
• 討論39-43
• 第三部分 脂肪間充質(zhì)干細胞增強血管內(nèi)皮細胞功能活性的分子機制43-67
• 材料43-46
• 方法46-54
• 結(jié)果54-63
• 討論63-67
• 小結(jié)67-69
• 參考文獻69-77
• 文獻綜述77-86
• 參考文獻81-86
• 附錄一86-97
• 個人簡歷和研究成果97-99
• 致謝#@@

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本文編號：982716