發(fā)布時間：2017-09-13 16:02

  本文關鍵詞：興奮性神經(jīng)元特異性表達Kir2.1通道通過上調(diào)miR-9抑制FoxP2翻譯而損傷學習和記憶

  更多相關文章： 神經(jīng)元活性 學習和記憶 Kir2.1 高通量測序 miR-9 FoxP2

【摘要】：[背景] 學習和記憶是人類大腦最主要的高級功能,其細胞和分子生物學機制一直是神經(jīng)科學研究的重點領域。已知神經(jīng)元是腦的主要構(gòu)成部分,其活性變化與突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關,而后者是學習和記憶形成的基礎。研究表明,在認知障礙疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease),帕金森病(Parkinson's disease)中,神經(jīng)元活性降低,突觸可塑性受損,導致學習和記憶功能障礙。目前,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量表觀遺傳學因素如老齡化、腦外傷在神經(jīng)元活性降低所引起的學習記憶障礙中的作用,但相應的作用及其機理尚不明了。隨著基因測序、芯片技術的飛速發(fā)展,表觀遺傳學對學習記憶的調(diào)控作用逐漸被揭示。人類大腦有數(shù)千億個神經(jīng)元,這些神經(jīng)元細胞可以表達19,814個蛋白相關基因和數(shù)千個非編碼RNA (non-coding RNAs, ncRNAs)。非編碼RNA的突變或表達異常與許多疾病的發(fā)生密切相關,研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNAs)作為非編碼RNA的主要成員可作用于神經(jīng)元的許多轉(zhuǎn)錄因子。此外,在神經(jīng)系統(tǒng)中與突觸蛋白合成有關的基因大多是miRNAs的潛在靶基因,miRNAs可以根據(jù)突觸活性的改變來調(diào)控局部蛋白質(zhì)的翻譯,進而調(diào)控突觸的生長和突觸傳遞的強度,但miRNA調(diào)控神經(jīng)元活性介導的學習和記憶的機制尚不清楚。 [目的] 運用條件誘導性轉(zhuǎn)基因小鼠模型,我們將揭示神經(jīng)元活性依賴的海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性調(diào)節(jié)的細胞分子機制,即在興奮性神經(jīng)元中過表達內(nèi)向整流性鉀離子通道2.1(Kir2.1)通過上調(diào)microRNA-9(miR-9),抑制其靶基因核轉(zhuǎn)錄因子FoxP2的表達,從而導致學習和記憶功能受損。本研究將為學習與記憶障礙相關疾病的藥物開發(fā)提供有效的分子靶點。 [方法] 我們首先將在北京百奧賽圖公司構(gòu)建的條件誘導性過表達Ai3-Flag-Kir2.1-2A-tdTomato小鼠(Tg1)與在興奮性神經(jīng)元中表達Cre重組酶CamKII-a-CreERT2小鼠(Tg2)雜交,通過PCR方法鑒定為雙雜陽性純合子后代通過他莫昔芬藥物條件性誘導小鼠特異性在興奮性神經(jīng)元過表達Kir2.1,簡寫為Kir2.1(+)小鼠。通過免疫熒光組織化學技術方法(IFC)、蛋白印跡(Western Blotting)、熒光定量PCR(qPCR)驗證Kir2.1在興奮性神經(jīng)元的過表達。然后通過腦片膜片鉗電生理技術檢測Kir2.1(+)小鼠的突觸傳遞可塑性是否受神經(jīng)元活性降低的影響。通過水迷宮(Morris Water Maze Test)、條件性恐懼實驗(Fear Conditioning Test)、T迷宮(T-maze Test)等實驗檢測學習和記憶相關行為。通過曠場(Open Field Test)、轉(zhuǎn)棒儀(Rotarod)、高架十字迷宮(Elevated Plus Maze)、強迫游泳(Forced Swimming Test)等實驗檢測學習和記憶不相關行為。通過高通量測序(NA-Seq)及有效組內(nèi)對比篩選出與神經(jīng)元活性及學習和記憶相關的基因miR-9和FoxP2。通過熒光定量PCR(qPCR)驗證miR-9在Kir2.1(+)小鼠表達升高,FoxP2在Kir2.1(+)小鼠表達下降。通過構(gòu)建野生型和突變型FoxP23'端UTR的熒光素酶表達載體確認miR-9和靶蛋白FoxP23'端UTR區(qū)的直接結(jié)合。通過腦立體定位在海馬齒狀回(Dendrite Gyrus, DG)區(qū)注射LNA-miR-9抑制小鼠海馬內(nèi)源性miR-9的表達。通過尾靜脈注射PUF-Fox-P抑制miR-9與FoxP2的3'UTR的直接結(jié)合。通過免疫印跡(Western Blotting)檢測給予LNA-9和Fox-P處理后Kir2.1(＋)小鼠FoxP2的蛋白表達增多。通過熒光定量(qPCR)檢測給予Fox-P處理后Kir2.1(+)小鼠FoxP2的mRNA水平無變化。隨后進行學習和記憶相關行為學及腦片膜片鉗電生理實驗,LNA-9和Fox-P處理組Kir2.1(+)小鼠的學習和記憶改善,突觸可塑性恢復至正常。通過腦立體腦定位在Kir2.1(-)小鼠DG區(qū)注射慢病毒Lenti-miR-9過表達外源性miR-9,在Kir2.1(＋)小鼠DG區(qū)注射慢病毒Lenti-FoxP2過表達外源性FoxP2,重復上述實驗,明確神經(jīng)元活性依賴的miR-9/FoxP2通路導致學習和記憶缺陷的機制。 [結(jié)果] 我們的研究結(jié)果顯示： (1)成功建立在興奮性神經(jīng)元中過表達功能性Kir2.1小鼠(Kir2.1(+)小鼠)；(2)Kir2.1(+)小鼠突觸傳遞功能正常,但海馬CA3-CA1環(huán)路LTP異常；(3)Kir2.1(+)小鼠其他表型正常,但學習和記憶功能發(fā)生障礙：(4)RNA測序發(fā)現(xiàn)Kir2.1(+)小鼠miR-9表達增加；(5)miR-9抑制下游靶基因FoxP2的蛋白翻譯；(6)下調(diào)miR-9能改善Kir2.1(+)小鼠學習和記功能受損；(7)上調(diào)miR-9導致Kir2.1(-)小鼠學習和記憶缺陷；(8)上調(diào)FoxP2改善Kir2.1(+)小鼠學習和記憶功能受損。 [結(jié)論] 興奮性神經(jīng)元過表達Kir2.1導致神經(jīng)元活性降低,miR-9表達增多并下調(diào)靶基因FoxP2的蛋白翻譯水平,引起海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性的改變,最終導致學習與記憶功能受損。通過抑制miR-9或者上調(diào)靶基因FoxP2的蛋白水平可以逆轉(zhuǎn)因神經(jīng)元活性降低所導致的海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性受損,進而逆轉(zhuǎn)學習和記憶功能障礙。
【關鍵詞】：神經(jīng)元活性 學習和記憶 Kir2.1 高通量測序 miR-9 FoxP2
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 目錄4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料方法14-47
• 結(jié)果47-66
• 討論66-71
• 小結(jié)71
• 創(chuàng)新點71-72
• 綜述72-90
• 參考文獻90-98
• 附錄一 攻讀博士學位期間已發(fā)表論文98-99
• 附錄二 攻讀博士學位期間參與的國家自然科學基金項目99
• 附錄三 攻讀博士學位期間參加的國際學術會議99-100
• 致謝100-102

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1 韋娜;興奮性神經(jīng)元特異性表達Kir2.1通道通過上調(diào)miR-9抑制FoxP2翻譯而損傷學習和記憶[D];華中科技大學;2015年

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1 蘇鑫;出生早期大腦皮層興奮性神經(jīng)元間的縫隙連接對于皮層發(fā)育的影響[D];復旦大學;2014年

2 周斌;髓樣分化因子88參與突觸功能調(diào)控的電生理研究[D];浙江大學;2014年

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本文編號：844651