本文關鍵詞：硫化氫參與植物細胞水澇低氧脅迫應答反應機制的研究

  更多相關文章： 硫化氫 低氧脅迫 細胞程序性死亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫 ROS NO 乙烯

【摘要】：氣候變化導致水澇災害在全球范圍內(nèi)頻繁發(fā)生,加之大多數(shù)農(nóng)作物(例如豌豆)屬于水澇敏感型植物,水澇災害最終導致農(nóng)作物產(chǎn)量明顯下降以至絕收。這主要是因為水澇環(huán)境限制了空氣尤其是氧氣(O2)和二氧化碳(C02)的流動,使得植物細胞正常的光合作用和呼吸作用受阻。同時,大量有毒代謝產(chǎn)物在細胞中積累最終造成細胞死亡。硫化氫(H2S)作為一種新型氣體信號分子參與動植物細胞的多種生物學過程,并作為02感受器調(diào)控動物細胞低氧脅迫應答反應,但至今尚無H2S參與植物細胞應答水澇低氧脅迫方面的報道。本研究以建立了完善水培體系的豌豆以及H2S代謝途徑擬南芥突變體desl-1(L-cysteine desulfhydrase)為材料,通過生理生化、細胞和分子生物學多種技術在分子水平上研究了H2S緩解水澇低氧脅迫造成的植物細胞死亡的分子機制。主要研究結果如下：1、Evans Blue染色發(fā)現(xiàn)水澇低氧脅迫最先導致根尖過渡區(qū)(TZ)細胞死亡,且DAB(顯示過氧化氫,H202)和NBT(顯示超氧根離子,O2·-)組織化學染色顯示ROS首先在TZ細胞中大量積累,表明根尖TZ細胞可能是感知水澇低氧脅迫最敏感的部位。2、豌豆幼苗經(jīng)外源H2S(由NaHS水解產(chǎn)生)預處理后進行水澇低氧脅迫處理,通過Evans Blue染色觀察發(fā)現(xiàn)NaHS預處理明顯緩解了水澇低氧脅迫造成的根尖細胞死亡。同時,DAB和NBT組織化學染色發(fā)現(xiàn)NaHS預處理明顯降低了ROS在TZ細胞中的積累。3、在NaHS預處理和水澇低氧脅迫處理階段添加內(nèi)源H2S合成酶抑制劑HA(hydroxylamine),可明顯影響根尖內(nèi)源H2S含量。Evans Blue染色顯示根尖細胞死亡程度與內(nèi)源H2S含量密切相關,表明H2S可能參與了植物細胞對水澇低氧脅迫的應答過程。4、NaHS預處理對乙醇發(fā)酵途徑關鍵酶PDC (pyruvate decarboxylase)和ADH(alcohol dehydrogenase)的活性影響不顯著,但明顯增加了GSH(glutathione)的含量以及APX (ascorbate peroxidase)的活性,表明H2S主要是通過提高植物細胞抗氧化系統(tǒng)活性增強其耐受水澇低氧脅迫的能力。5、通過H2S和NO (nitric oxide)特異性熒光染料染色觀察,發(fā)現(xiàn)NaHS預處理可明顯增加擬南芥野生型內(nèi)源H2S和NO含量；而突變體des1-1中H2S和NO含量明顯低于野生型；Evans Blue染色結果也表明desl-1耐受水澇低氧脅迫能力明顯低于野生型,表明H2S與NO相互作用共同調(diào)控植物細胞水澇低氧脅迫應答反應。6、基因DESl的突變明顯影響了N-end rule途徑中標志基因ATE1 (Arg-tRNA transferase), ATE2, PRT6 (proteolysis), HRE1 (hypoxia responsive), HRE2, RAP2.12 (related to AP2.12), PCO1 (plant cysteine oxidase)和PC02的表達量,表明H2S通過影響N-end rule途徑關鍵基因的表達參與植物細胞對低氧水平的感知；同時DES1的突變也明顯影響了ER stress標志基因bZIP17 (basic domain/leucine zipper), bZIP28, bZIP60, BiP (bindingprotein), TIN(tunicamycin induced)和ERO (ER oxidoreductase)的表達量,表明H2S通過影響蛋白質(zhì)的正確折疊來調(diào)控水澇低氧脅迫引起的細胞死亡。7、NaHS預處理明顯抑制了豌豆根尖細胞乙烯的產(chǎn)生和ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)活性。此外,基因DES1的突變明顯上調(diào)了擬南芥突變體desl-1中乙烯受體基因ETR2 (ethylene receptor)的表達。結合Evans Blue染色以及根長測定結果,表明H2S通過抑制乙烯的合成和感知途徑啟動了靜止生長策略,以降低水澇低氧脅迫下能量的過度消耗。8、為了進一步揭示H2S參與水澇低氧脅迫應答和調(diào)控細胞死亡的生理和分子機制,我們構建了H2S代謝途徑關鍵基因OAS-Al(O-acetyl-L-serine(thiol)lyase)和DESl的35S啟動子、自身啟動子過表達載體以及RNAi載體,并成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,以期獲得OAS-Al和DES1過表達和RNAi轉(zhuǎn)基因植株,并對這些轉(zhuǎn)基因植株的水澇低氧脅迫耐受性進行分析。綜上所述,H2S通過與NO、ROS以及植物激素乙烯等相互作用,共同調(diào)控植物細胞對水澇低氧脅迫的應答過程,最終緩解水澇低氧脅迫引起的植物細胞死亡。本研究不僅具有重要科學意義,同時還為提高農(nóng)作物耐受水澇低氧脅迫提供新的研究思路。
【關鍵詞】：硫化氫 低氧脅迫 細胞程序性死亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫 ROS NO 乙烯
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q942.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 主要縮略詞表8-13
• 第一章 緒論13-27
• 1.1 植物細胞水澇低氧脅迫的研究現(xiàn)狀13-19
• 1.1.1 植物應答水澇低氧脅迫的遺傳學機制13-15
• 1.1.2 水澇低氧脅迫造成植物細胞死亡的原因分析15-16
• 1.1.3 水澇低氧脅迫引起的植物細胞死亡可能是一種PCD過程16
• 1.1.4 植物細胞通過N-末端規(guī)則(N-end rule)感知低氧脅迫16-19
• 1.2 H_2S在植物細胞中的研究進展19-22
• 1.2.1 植物細胞對硫酸鹽的同化19-20
• 1.2.2 H_2S在植物細胞中的合成和分解代謝20-21
• 1.2.3 H_2S作為信號分子參與植物細胞的許多生物學進程21-22
• 1.3 H_2S參與動物細胞低氧感知的研究現(xiàn)狀22-24
• 1.3.1 動物細胞低氧感知機制22-23
• 1.3.2 H_2S是動物細胞的氧氣感受器23-24
• 1.4 H_2S參與植物細胞水澇低氧脅迫研究進展和存在的問題24-25
• 1.5 本研究的切入點25-26
• 1.5.1 從ER stress角度研究H_2S參與植物細胞低氧感知的細胞和分子機制25-26
• 1.5.2 研究水澇低氧脅迫下植物細胞中H_2S與ROS以及NO之間的相互作用26
• 1.6 研究目的和意義26-27
• 第二章 H_2S增強豌豆耐受水澇低氧脅迫的研究27-51
• 2.1 材料與方法27-33
• 2.1.1 試劑27
• 2.1.2 實驗材料培養(yǎng)、處理和取樣27-28
• 2.1.3 根尖細胞死亡程度檢測28-29
• 2.1.4 根部溶解氧含量測定29
• 2.1.5 O_2~(·-) 和H_2O_2的組織化學染色29
• 2.1.6 O_2~(·-)含量測定29
• 2.1.7 H_2O_2含量測定29-30
• 2.1.8 根尖內(nèi)源H_2S含量測定30
• 2.1.9 H_2S代謝途徑關鍵酶活性測定30-31
• 2.1.10 抗氧化系統(tǒng)APX、SOD和CAT酶活性測定31
• 2.1.11 GSH含量測定31-32
• 2.1.12 根尖細胞膜完整性檢測32
• 2.1.13 乙烯含量和ACO活性測定32
• 2.1.14 發(fā)酵途徑PDC、ADH和LDH酶活性分析32-33
• 2.1.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計33
• 2.2 結果33-45
• 2.2.1 水澇低氧脅迫導致ROS在根尖過渡區(qū)細胞大量積累33-35
• 2.2.2 H_2S預處理增強豌豆耐受水澇低氧脅迫以及水澇過后恢復生長的能力35-37
• 2.2.3 水澇低氧脅迫對豌豆根尖細胞內(nèi)源H_2S含量的影響37
• 2.2.4 H_2S降低ROS在根尖細胞的積累37-39
• 2.2.5 H_2S增強根尖細胞抗氧化系統(tǒng)的能力39-40
• 2.2.6 H_2S對豌豆根尖細胞H_2S代謝途徑關鍵酶活性的影響40-41
• 2.2.7 H_2S對根尖細胞發(fā)酵代謝途徑酶活性的影響41-42
• 2.2.8 H_2S抑制根尖細胞乙烯的產(chǎn)生42-43
• 2.2.9 H_2S預處理增強豌豆根尖細胞膜的完整性43
• 2.2.10 H_2S可能參與植物細胞對水澇低氧脅迫的應答反應43-45
• 2.3 討論45-49
• 2.3.1 豌豆根尖過渡區(qū)細胞可能是感知水澇低氧脅迫最敏感的部位45-46
• 2.3.2 H_2S通過抗氧化系統(tǒng)而不是發(fā)酵途徑來增強豌豆耐受水澇低氧脅迫能力46-47
• 2.3.3 H_2S可能參與植物細胞水澇低氧脅迫應答過程47-49
• 2.4 小結49-51
• 第三章 H_2S代謝突變體des1-1水澇低氧脅迫耐受性研究51-66
• 3.1 材料與方法51-54
• 3.1.1 試劑51
• 3.1.2 實驗材料培養(yǎng)、處理和取樣51-52
• 3.1.3 葉片和根尖細胞死亡程度檢測52
• 3.1.4 O_2~(·-)和H_2O_2的組織化學染色和含量測定52
• 3.1.5 H_2S代謝途徑關鍵酶活性以及抗氧化系統(tǒng)活性測定52
• 3.1.6 根尖細胞膜完整性檢測52
• 3.1.7 擬南芥CAS電泳圖譜分析52-53
• 3.1.8 植物根尖細胞程序性死亡(PCD)檢測53
• 3.1.9 植物根尖內(nèi)源H_2S和NO熒光強度檢測53-54
• 3.1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計54
• 3.2 結果54-62
• 3.2.1 擬南芥水培體系以及水澇低氧脅迫處理體系的建立54-55
• 3.2.2 H_2S對擬南芥種子萌發(fā)和根伸長生長的影響55-56
• 3.2.3 H_2S預處理增強擬南芥耐受水澇低氧脅迫以及復氧后恢復生長的能力56-57
• 3.2.4 H_2S代謝途徑突變體des1-1水澇低氧脅迫耐受性分析57-58
• 3.2.5 水澇低氧脅迫對擬南芥Col和des1-1內(nèi)源H_2S含量的影響58-59
• 3.2.6 水澇低氧脅迫對CSase同工酶活性的影響59-60
• 3.2.7 水澇低氧脅迫對擬南芥Col和des1-1內(nèi)源NO含量的影響60-61
• 3.2.8 水澇低氧脅迫造成的植物細胞死亡可能是一種PCD過程61-62
• 3.3 討論62-65
• 3.3.1 H_2S對植物種子萌發(fā)和根生長的影響62-63
• 3.3.2 H_2S增強植物細胞水澇低氧脅迫耐受性具有普遍性63
• 3.3.3 H_2S與NO、ROS之間相互作用共同調(diào)控植物細胞應答水澇低氧脅迫63-65
• 3.4 小結65-66
• 第四章 H_2S在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控植物細胞水澇低氧脅迫應答的研究66-85
• 4.1 材料與方法66-69
• 4.1.1 試劑66
• 4.1.2 實驗材料培養(yǎng)及取樣方法66-67
• 4.1.3 RNA提取方法67
• 4.1.4 qRT-PCR方法67-69
• 4.2 結果69-77
• 4.2.1 H_2S對ROS產(chǎn)生和清除途徑關鍵基因表達的影響69-70
• 4.2.2 H_2S對N-end rule途徑關鍵基因表達的影響70-71
• 4.2.3 H_2S對植物細胞PCD途徑關鍵基因表達的影響71-73
• 4.2.4 H_2S對植物細胞H_2S代謝途徑關鍵基因表達的影響73-74
• 4.2.5 H_2S對ER stress途徑關鍵基因表達的影響74-76
• 4.2.6 H_2S對中乙烯受體基因ETR2表達的影響76
• 4.2.7 H_2S對糖代謝及乙醇發(fā)酵代謝途徑關鍵基因表達的影響76-77
• 4.3 討論77-84
• 4.3.1 H_2S可能通過N-end rule途徑參與植物細胞對低氧水平的感知77-79
• 4.3.2 H_2S可能通過抑制乙烯的合成和感知啟動了靜止生長策略79-81
• 4.3.3 H_2S可能通過ER-stress途徑參與植物細胞水澇低氧脅迫應答反應81-84
• 4.4 小結84-85
• 第五章 DES1和OASA1過表達及RNAi載體構建和遺傳轉(zhuǎn)化85-95
• 5.1 材料與方法85-87
• 5.1.1 菌株和質(zhì)粒85
• 5.1.2 試劑、酶和引物85
• 5.1.3 DES1和OASA1基因RNAi載體構建85-86
• 5.1.4 DES1和OASA1基因自身啟動子和35S啟動子過表達載體構建86-87
• 5.1.5 農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化實驗87
• 5.1.6 花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥實驗87
• 5.2 結果87-93
• 5.2.1 DES1/OASA1-RNAi載體構建87-91
• 5.2.2 DES1/OASA1-35S和自身啟動子過表達載體構建91-93
• 5.3 討論和小結93-95
• 第六章 結論與展望95-99
• 6.1 結論95-97
• 6.1.1 H_2S增強植物耐受水澇低氧脅迫能力具有普遍性和實際應用價值95
• 6.1.2 H_2S通過增強細胞抗氧化脅迫能力提高植物水澇低氧脅迫耐受性95
• 6.1.3 H_2S通過抑制乙烯的合成和感知啟動了植物細胞靜止生長策略95-96
• 6.1.4 H_2S通過N-end rule和ER stress途徑調(diào)控植物水澇低氧脅迫應答過程96-97
• 6.2 展望97-99
• 6.2.1 擬南芥H_2S代謝途徑另一重要突變體oasa1水澇低氧脅迫耐受性分析97-98
• 6.2.2 擬南芥ER stress代謝途徑突變體水澇低氧脅迫耐受性分析98
• 6.2.3 H_2S與其它植物激素共同調(diào)控水澇低氧脅迫下植物靜止生長策略的研究98-99
• 本研究創(chuàng)新點99-100
• 參考文獻100-109
• 就讀期間主要研究成果109-110
• 致謝110-111

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 ;Hydrogen sulfide induced by nitric oxide mediates ethylene-induced stomatal closure of Arabidopsis thaliana[J];Chinese Science Bulletin;2011年33期

2 ;Hydrogen Sulfide Promotes Wheat Seed Germination and Alleviates Oxidative Damage against Copper Stress[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年12期

3 ;Hydrogen Sulfide Promotes Root Organogenesis in Ipomoea batatas, Salix matsudana and Glycine max[J];Journal of Integrative Plant Biology;2009年12期

4 Francesco Licausi;Chiara Pucciariello;Pierdomenico Perata;;New Role for an Old Rule: N-end Rule-Mediated Degradation of Ethylene Responsive Factor Proteins Governs Low Oxygen Response in Plants[J];Journal of Integrative Plant Biology;2013年01期

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本文編號：717268