本文關鍵詞：超積累植物東南景天Cd耐性和積累的分子機制

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【摘要】：近年來,由于土壤重金屬污染情況日益嚴重,因此對重金屬超積累作用機理的研究是當今國內外研究的熱點。本研究探究了超積累植物東南景天對鎘的耐性和積累機制。本研究在前期轉錄組測序的基礎上,發(fā)掘出一些可能與鎘超積累植物東南景天鎘超積累作用相關的基因,并綜合利用分子克隆、生物信息學分析、RT-PCR、酵母功能互補、植物過表達、洋蔥表皮細胞定位等手段對它們的功能進行了研究,并探討了它們在東南景天鎘耐性和積累過程中的作用以及東南景天鎘耐性和積累的機理。本研究所取得的主要研究結果如下：1、通過同源克隆技術,克隆到一個東南景天P-1B型ATP酶基因(SaHMA3)。超積累生態(tài)型與非超積累生態(tài)型東南景天SaHMA3基因都表現出在根系和地上部組成型表達,并且都編碼液泡膜上定位的轉運子,但是不同之處在于其轉運底物的選擇性及表達水平差異。超積累生態(tài)型東南景天SaHMA3h是一個鎘的特異轉運子,而非超積累生態(tài)型SaHMA3n既能轉運鎘也能轉運鋅。從表達水平來看,SaHMA3在超積累生態(tài)型不管是根系還是地上部的表達水平都顯著高于非超積累生態(tài)型；而且,在超積累生態(tài)型體內,SaHMA3在地上部的表達量要明顯高于根部。過表達SaHMA3h顯著提高了煙草植物對鎘的耐性和積累量,但是降低了鎘從根部向地上部的轉運。由此可見,東南景天SaHMA3在東南景天鎘耐性及積累過程中起著重要的作用。2、SaMT2基因編碼一個含79個氨基酸殘基的蛋白,其包含兩個富含半胱氨酸的結構域。在東南景天體內,SaMT2的表達水平表現為地上部高于根部,并且顯著地受鎘和鋅處理的誘導。酵母功能互補實驗表明SaMT2可以顯著地提高酵母對鎘的積累與耐性,而不能提高對鋅的耐性。將SaMT2在煙草中過表達后發(fā)現,過表達SaMT2的煙草根部和地上部對鎘的積累及耐性都有明顯提高。在鎘處理條件下,轉基因煙草相比野生型植物具有更高的抗氧化酶活性,更少的過氧化氫積累。因此,本研究表明東南景天SaMT2可以通過與金屬結合和改善抗氧化系統(tǒng)來提高轉基因煙草對鎘的耐性和積累。3、NRAMP家族(Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins)蛋白是一類廣泛存在于植物、動物、微生物體內的鐵、錳、鎘等金屬的轉運蛋白,在鐵、錳、鎘等金屬離子的穩(wěn)態(tài)過程中起重要的作用。本研究在前期課題組對東南景天轉錄組測序的基礎上,分析挖掘出五個NRAMP家族基因,并利用生物信息學、RT-PCR、酵母功能互補、植物過表達、洋蔥表皮細胞定位等技術對東南景天NRAMP家族基因的功能進行了研究,探討了它們與東南景天鎘轉運之間的關系。結果表明,這5個NRAMP家族基因所編碼的氨基酸序列相互之間同源性表現出比較大的差異,它們之間的相似度在30%-84%之間,其中SaNramp3和SaNramp4之間的相似度最高,達到了接近84%。同其它植物的NRAMP蛋白一樣,東南景天的NRAMP都包含12個跨膜結構域以及一個保守程度非常高的轉運結構域,位于第8和第9個跨膜域之間。進化樹分析發(fā)現,NRAMP家族的蛋白可以分成兩個亞組,其中SaNramp1和SaNramp6屬于一個亞組,而SaNramp2、 SaNramp3和SaNramp4屬于另一個亞組。東南景天NRAMP家族基因在表達水平上存在比較大的差異,其中SaNramp3表達量最高。超積累生態(tài)型中SaNrampl. SaNramp3、SaNramp6都在地上部表達量比較高,根部表達量較低。在超積累生態(tài)型中這些基因的表達水平受金屬的調控較小,在非超積累生態(tài)型中,SaNrampl則顯著受鎘處理的誘導,然而SaNramp3顯著受鋅、鎘及缺鐵處理的誘導,SaNramp6在不同金屬處理下變化不大。洋蔥表皮細胞定位試驗發(fā)現SaNrampl、 SaNramp6定位于細胞膜上,而SaNramp3定位于液泡膜上。酵母功能互補及植物過表達試驗表明SaNrampl是一個鎘、錳、鋅的轉運子,SaNramp3是一個鎘、錳、鐵的轉運子,而SaNramp6是一個鎘和錳的轉運子。因此,可見東南景天NRAMP家族蛋白在鎘的轉運積累過程中起重要的作用。
【關鍵詞】：超積累植物 鎘 HMA3 MT2 NRAMP 分子機制
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X173;Q945.78
【目錄】：

• 致謝7-11
• 中文摘要11-13
• ABSTRACT13-16
• 主要縮略詞表16-17
• 第一章 文獻綜述17-33
• 1.1 鎘等重金屬的危害、污染現狀及應對措施17-20
• 1.1.1 鎘等重金屬的危害17-18
• 1.1.2 土壤中重金屬的污染現狀18-19
• 1.1.3 應對措施19-20
• 1.2 植物超積累重金屬的機理研究進展20-27
• 1.2.1 超積累植物20-21
• 1.2.2 植物重金屬的超積累機理研究進展21-27
• 1.3 重金屬積累與耐性相關基因研究進展27-30
• 1.4 本研究的意義及研究內容30-33
• 第二章 東南景天鎘耐性與HMA3基因功能的關系研究33-55
• 摘要33
• 2.1 引言33-35
• 2.2 材料及方法35-40
• 2.2.1 植物材料與培養(yǎng)35-36
• 2.2.2 SaHMA3基因的克隆36
• 2.2.3 SaHMA3基因的表達分析36-37
• 2.2.4 Southern blot分析37
• 2.2.5 質粒構建37-38
• 2.2.6 GFP定位38-39
• 2.2.7 酵母功能研究39
• 2.2.8 植物過表達分析39-40
• 2.2.9 數據分析40
• 2.3 結果與分析40-51
• 2.3.1 SaHMA3基因的克隆及序列分析40-43
• 2.3.2 SaHMA3基因的表達水平43-45
• 2.3.3 SaHMA3的定位45-47
• 2.3.4 SaHMA3的酵母功能研究47-49
• 2.3.5 煙草過表達SaHMA3h后對鎘、鋅的耐性及積累分析49-51
• 2.4 討論51-55
• 第三章 東南景天鎘耐性與MT2基因功能的關系研究55-69
• 摘要55
• 3.1 引言55-57
• 3.2 材料及方法57-60
• 3.2.1 植物培養(yǎng)57
• 3.2.2 SaMT2基因的克隆及序列分析57
• 3.2.3 定量PCR分析57-58
• 3.2.4 載體構建58
• 3.2.5 酵母功能分析58-59
• 3.2.6 轉基因煙草的構建及其金屬耐性與積累分析59
• 3.2.7 SOD,POD,CAT和H_2O_2的測定59-60
• 3.2.8 數據分析60
• 3.3 結果與分析60-66
• 3.3.1 SaMT2基因的克隆及序列分析60-61
• 3.3.2 東南景天體內SaMT2基因的表達水平61-62
• 3.3.3 SaMT2的酵母功能互補分析62-64
• 3.3.4 轉基因煙草的耐性與積累分析64-66
• 3.4 討論66-69
• 第四章 東南景天鎘積累與NRAMP家族基因的關系研究69-95
• 摘要69-70
• 4.1 引言70-71
• 4.2 材料與方法71-76
• 4.2.1 植物培養(yǎng)71
• 4.2.2 NRAMP家族基因的克隆71-73
• 4.2.3 NRAMP家族基因序列分析73
• 4.2.4 NRMMP家族基因的表達分析73-74
• 4.2.5 質粒構建74
• 4.2.6 GFP定位74-75
• 4.2.7 酵母功能研究75
• 4.2.8 植物過表達分析75-76
• 4.2.9 數據分析76
• 4.3 結果與分析76-91
• 4.3.1 東南景天NRAMP家族基因的序列分析76-79
• 4.3.2 東南景天NRAMP家族基因的表達量分析79-83
• 4.3.3 東南景天NRAMP蛋白的亞細胞定位分析83-84
• 4.3.4 東南景天NRAMP蛋白的酵母功能分析84-87
• 4.3.5 東南景天NRAMP家族基因在植物中的功能分析87-91
• 4.4 討論91-95
• 第五章 綜合討論與研究展望95-97
• 5.1 綜合討論95-96
• 5.2 主要創(chuàng)新點96
• 5.3 研究展望96-97
• 參考文獻97-117
• 攻讀博士學位期間主要成果117-11

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