本文關(guān)鍵詞：水稻減數(shù)分裂基因OsXRCC3的克隆和功能鑒定

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【摘要】：減數(shù)分裂是真核生物在有性生殖過程中發(fā)生的一種特殊的細胞分裂方式,其整個過程中染色體只復(fù)制一次而細胞連續(xù)分裂二次,最終形成染色體數(shù)目僅為性母細胞一半的配子。雌雄配子通過受精作用又恢復(fù)親代的染色體數(shù)目,這樣就保證了物種染色體數(shù)目的穩(wěn)定。在減數(shù)分裂前期Ⅰ,同源染色體之間通過配對聯(lián)會和重組等一系列復(fù)雜的相互作用而穩(wěn)定在一起,從而保證了同源染色體在后期Ⅰ的準確分離。另外,在減數(shù)分裂過程中同源染色體的非姐妹染色單體之間發(fā)生了交換,使配子的遺傳發(fā)生了多樣化,增加了后代的適應(yīng)性。在生物體中,同源重組過程中涉及到了很多基因。其中,RAD5是RecA重組酶的同源物,它催化單鏈的入侵和異源雙鏈的形成。在動植物中都有RAD51的5個旁系同源基因(RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3),它們在同源重組過程扮演著重要的角色。RAD51家族在同源重組和維持基因組的完整性等方面起著重要作用,在不同的物種之間它們在功能上有所分化。在本研究中,我們通過圖位克隆的方法在水稻克隆了影響重組的OsXRCC3基因。xrcc3突變體營養(yǎng)生長正常,但是雌雄配子完全不育。細胞學觀察發(fā)現(xiàn)在xrcc3突變體中同源染色體不能正常配對和聯(lián)會。染色體在中期Ⅰ發(fā)生相互纏繞,導(dǎo)致在后期Ⅰ形成大量的染色體碎片。免疫熒光染色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)突變體中γH2AX的信號正常,說明DNA雙鏈斷裂在xrcc3突變體中能正常形成。然而,COM1不能正常定位到染色體上,說明雙鏈斷裂末端的加工過程在xrcc3突變體中受到影響。并且在xrcc3突變體中,同源重組過程中的標記蛋白RAD51C、DMC1、ZIP4和MER3不能正常定位到染色體上,也進一步證明了在xrcc3突變體中同源染色體的重組不能正常進行。另外,我們還發(fā)現(xiàn)在xrcc3的突變體中,聯(lián)會復(fù)合體的軸向元件REC8、PAIR2和PAIR3能夠正常定位到染色體上,而橫向元件ZEP1在染色體上不能正常定位,說明在突變體中聯(lián)會復(fù)合體不能正常形成。因此,我們認為XRCC3在水稻DNA雙鏈斷裂末端加工、同源染色體聯(lián)會和重組過程中起著重要作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)XRCC3還參與了絲裂霉素C介導(dǎo)的有絲分裂的DNA損傷修復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：DNA雙鏈斷裂 同源重組 減數(shù)分裂 水稻 XRCC3
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮寫略表9-11
• 第一章 文獻綜述11-33
• 1.1 減數(shù)分裂及其生物學意義11
• 1.2. 減數(shù)分裂的過程11-15
• 1.2.1 減數(shù)分裂的間期(pre-meiotic interphase)11
• 1.2.2 前期Ⅰ(prophase Ⅰ)11-13
• 1.2.3 中期Ⅰ(metaphase Ⅰ)13
• 1.2.4 后期Ⅰ(anaphase Ⅰ)13
• 1.2.5 末期Ⅰ(telophase Ⅰ)13
• 1.2.6 減數(shù)分裂Ⅱ13-15
• 1.3 減數(shù)分裂前期Ⅰ發(fā)生的重要生物學事件15
• 1.4 同源重組機制15-17
• 1.4.1 同源重組雙鏈斷裂修復(fù)模型16-17
• 1.5 參與同源重組的蛋白17-25
• 1.5.1 參與DSB形成的相關(guān)蛋白：SPO11及其輔助蛋白17-20
• 1.5.2 參與DSB加工的蛋白：MRX復(fù)合體和COM1/SAE2/CtIP20
• 1.5.3 參與單鏈入侵和異源雙鏈形成的蛋白：RAD51、DMC1及其輔助蛋白20-22
• 1.5.4 參與交叉形成的蛋白22-25
• 1.6 DSB雙鏈斷裂修復(fù)機制25-27
• 1.7 聯(lián)會復(fù)合體的形成27-29
• 1.8 植物減數(shù)分裂的研究29-32
• 1.9 論文研究意義和目標32-33
• 1.9.1 研究意義32
• 1.9.2 研究目標32-33
• 第二章 材料與方法33-44
• 2.1 實驗材料33-34
• 2.1.1 水稻材料33
• 2.1.2 質(zhì)粒及菌株33
• 2.1.3 工具酶及各種生化試劑33
• 2.1.4 本研究所用蛋白的序列號(accession number)33-34
• 2.2 實驗方法34-44
• 2.2.1 水稻總DNA的提取34
• 2.2.2 分子標記的開發(fā)與基因的圖位克隆34
• 2.2.3 水稻總RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄34-35
• 2.2.4 半定量RT-PCR分析35-36
• 2.2.5 質(zhì)粒DNA小量提取36-37
• 2.2.6 農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)的制備37
• 2.2.7 電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌37-38
• 2.2.8 互補載體的構(gòu)建及水稻基因轉(zhuǎn)化38-40
• 2.2.9 潮霉素抗性鑒定與轉(zhuǎn)基因陽性苗的鑒定40-41
• 2.2.10 減數(shù)分裂時期染色體的制備41
• 2.2.11 熒光原位雜交實驗41-43
• 2.2.12 染色體蛋白質(zhì)免疫檢測43-44
• 第三章 結(jié)果與分析44-69
• 3.1 Osxrcc3-1突變體的分離44-45
• 3.2 突變體的遺傳分析45-46
• 3.3 OsXRCC3基因的圖位克隆46-52
• 3.4 功能互補驗證52-53
• 3.5 OsXRCC3基因的突變導(dǎo)致減數(shù)分裂發(fā)生異常53-56
• 3.6 在Osxrcc3-1突變體中同源染色體不能配對56-57
• 3.7 在Osxrcc3-1突變體中,DSB能夠正常形成57-59
• 3.8 在Osxrcc3-1突變體中,聯(lián)會復(fù)合體不能正常的裝配59-62
• 3.9 COM1,RAD51C和DMC1在染色體上的定位依賴于XRCC362-63
• 3.10 XRCC3對于MER3和ZIP4在染色體上的定位是必須的63-67
• 3.11 OsXRCC3突變導(dǎo)致幼苗對絲裂霉素C敏感性增加67-69
• 第四章 討論69-72
• 4.1 XRCC3蛋白在水稻同源染色體的聯(lián)會和重組過程中起著非常重要的作用69
• 4.2 在不同生物體中XRCC3功能的保守與分化69-70
• 4.3 Osxrcc3突變體中可能發(fā)生了非同源染色體的重組70-72
• 第五章 結(jié)論與展望72-73
• 5.1 結(jié)論72
• 5.2 研究展望72-73
• 參考文獻73-83
• 附錄83-85
• 致謝85-87
• 博士在讀期間發(fā)表的論文87
• 博士在讀期間申請的專利87

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