發(fā)布時間：2017-07-05 17:21

  本文關(guān)鍵詞：里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中碳源感應(yīng)機(jī)制的研究

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【摘要】：木質(zhì)纖維素是自然界中含量最為豐富的可再生資源,其高效循環(huán)利用將有效緩解日益嚴(yán)重的能源資源危機(jī)。由纖維素特殊的結(jié)構(gòu)組成所形成的天然抗降解屏障是制約其利用的主要瓶頸。自然界中存在許多纖維素降解微生物,它們能夠高效利用纖維素類底物,為纖維素的轉(zhuǎn)化利用提供了一條有效途徑。絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)便是纖維素降解微生物中的典型代表。由于木質(zhì)纖維素為水不溶性底物,里氏木霉如何感應(yīng)胞外纖維素存在進(jìn)而觸發(fā)纖維素酶基因表達(dá)以及纖維素來源的信號是如何被感應(yīng)和傳遞等問題至今沒有明確答案。本論文以里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中碳源感應(yīng)為切入點,分別從纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白和無轉(zhuǎn)運活性的類纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白兩方面研究了纖維素酶編碼基因啟動表達(dá)的機(jī)理,主要得到以下結(jié)果：1.構(gòu)建了纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白篩選系統(tǒng),并首次在里氏木霉中鑒定得到具有纖維二糖轉(zhuǎn)運活性的轉(zhuǎn)運蛋白Stpl。利用釀酒酵母不能代謝纖維二糖的特性,通過代謝工程的手段分別在釀酒酵母中表達(dá)β-葡萄糖苷酶和候選纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白,并通過重組酵母以纖維二糖為碳源時的生長情況判定候選轉(zhuǎn)運蛋白是否具有纖維二糖轉(zhuǎn)運活性。以此重組酵母為平臺,結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測鑒定到了里氏木霉中第一個具有纖維二糖轉(zhuǎn)運活性的轉(zhuǎn)運蛋白,由于它兼有葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)運活性,因此將其命名為Sugar Transporter 1,簡稱Stp1。2.通過基因敲除證明里氏木霉Stp1不僅影響菌體對纖維二糖的利用,同時對里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)也有重要的影響。為研究纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白在里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)中的作用,通過同源雙交換的策略在里氏木霉野生型菌株TU6中對stp1進(jìn)行敲除,成功得到Stp1缺失突變株△stp1。研究表明,Stp1的缺失一定程度上影響了里氏木霉對纖維二糖的利用,相比于野生型菌株,△stp1以纖維二糖為碳源時生長變慢且最終生物量積累變少。并且Stp 1的缺失致使里氏木霉在纖維素誘導(dǎo)時其纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄及發(fā)酵液纖維素酶酶活大幅度提升；而相反的是△stp1的纖維素酶表達(dá)不再受纖維二糖的誘導(dǎo)。進(jìn)一步分析表明Stp1缺失后對纖維二糖響應(yīng)的消失是由于胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高引起,升高的β-葡萄糖苷酶酶活加速胞外纖維二糖水解,產(chǎn)生更多的葡萄糖從而引起葡萄糖阻遏效應(yīng)抑制纖維素酶基因的表達(dá)。但胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高并不是纖維素誘導(dǎo)時△stp1菌株纖維素酶酶活升高的主要原因,且Stp1的缺失并不影響槐糖對纖維素酶的誘導(dǎo)。另外,研究還發(fā)現(xiàn)Stp1并不能解除纖維素為碳源時纖維素酶誘導(dǎo)過程中的葡萄糖阻遏效應(yīng),至少高濃度葡萄糖存在時Stp1并沒有明顯的解阻遏作用,考慮到Stp1所具備的葡萄糖轉(zhuǎn)運活性,推測纖維素酶表達(dá)過程中Stp1的缺失可能通過減緩葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運而在一定程度上減緩了葡萄糖阻遏效應(yīng)的發(fā)生,因此使纖維素酶分泌表達(dá)加強(qiáng)。3.通過表達(dá)譜測序,從全基因組水平上檢測了野生型菌株TU6和△stp1在纖維素誘導(dǎo)時的基因轉(zhuǎn)錄差異,發(fā)現(xiàn)一新的類糖轉(zhuǎn)運蛋白Tr_3405,且其在△stp1中的轉(zhuǎn)錄得到上調(diào)。為更全面地研究△stp1高纖維素酶活的原因,對野生型菌株和△stp1菌株進(jìn)行了纖維素誘導(dǎo)下的表達(dá)譜測序。野生型菌株755個基因受Avicel誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),其中包括17個纖維素酶編碼基因和28個半纖維素酶編碼基因。受Avicel誘導(dǎo)上調(diào)的這些基因中有98個基因為分泌蛋白編碼基因；21個預(yù)測為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；31個基因編碼轉(zhuǎn)運蛋白,其中這31個轉(zhuǎn)運蛋白中有17個與Stp1一樣屬于MFS超家族；還有30個基因與蛋白分泌有關(guān)；另外的282個基因?qū)儆谖粗δ艿鞍拙幋a基因。整體表達(dá)譜測序結(jié)果顯示,△stp1中的基因表達(dá)譜與野生型菌株相比有697個基因的表達(dá)有明顯差別,其中包括139個表達(dá)上調(diào)基因和532個下調(diào)表達(dá)的基因。差異基因中預(yù)測為糖轉(zhuǎn)運蛋白的MFS超家族的Tr 3405受纖維素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)十分顯著,而且其在△stp1中轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步升高。熒光定量PCR和Northern blot實驗進(jìn)一步驗證了Tr 3405受纖維素誘導(dǎo)而發(fā)生上調(diào)表達(dá)。4.通過過表達(dá)和基因敲除,證明類糖轉(zhuǎn)運蛋白Tr_3405是里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)所必須的調(diào)節(jié)因子,將其命名為Cellulase regulating transporter 1,簡稱Crtl。熒光定量PCR結(jié)果顯示當(dāng)Tr 3405過表達(dá)時可以顯著提高纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)一步通過同源雙交換策略對Tr 3405進(jìn)行敲除,發(fā)現(xiàn)Tr 3405的缺失致使里氏木霉不論是在纖維素、纖維二糖為底物還是槐糖誘導(dǎo)的條件下其纖維素酶均不再表達(dá),由此說明Tr 3405是里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)所必須的調(diào)節(jié)因子。生物信息學(xué)分析顯示Tr 3405在進(jìn)化上與粗糙脈孢菌纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白Cdt1和Cdt2及乳酸克魯維屬酵母乳糖轉(zhuǎn)運蛋白Lacl2具有較高的一致性。但是纖維二糖和槐糖轉(zhuǎn)運實驗表明Tr 3405并不具有纖維二糖或槐糖轉(zhuǎn)運活性。因此,Tr 3405可能是以無轉(zhuǎn)運活性類轉(zhuǎn)運蛋白的形式參與胞外誘導(dǎo)信號的感應(yīng)。由此,我們將Tr 3405蛋白命名為類轉(zhuǎn)運蛋白纖維素酶調(diào)節(jié)因子(Cellulase regulating transporter 1,簡稱Crt1)。通過pull-down實驗釣取了與Crt1相互作用的蛋白,進(jìn)一步研究Crt1的信號感應(yīng)與傳遞的分子機(jī)制,初步結(jié)果表明Crt1的C端并不穩(wěn)定,這可能與Crt1的信號傳遞功能有關(guān),更深入的實驗結(jié)果待進(jìn)一步分析。5.發(fā)現(xiàn)了一種新型纖維素酶誘導(dǎo)碳源一葡萄糖酸內(nèi)酯。本論文研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸內(nèi)酯擁有略高于纖維二糖的纖維素酶誘導(dǎo)效果,且能夠作為唯一碳源供里氏木霉生長,這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個單糖衍生物類的纖維素酶誘導(dǎo)物。研究表明,葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)需要Crt1和纖維素酶基因關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Xyrl的參與,不論是Crt1還是Xyr1的缺失都會消除葡萄糖酸內(nèi)酯對纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步研究表明,胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶Cell a在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)過程中至關(guān)重要,它的缺失致使菌體在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)下其纖維素酶不再表達(dá),而胞外β-葡萄糖苷酶Bgl1并不影響葡萄糖酸內(nèi)酯的誘導(dǎo)。與纖維素的誘導(dǎo)不同,葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶的表達(dá)受Stp1正調(diào)控,Stpl的缺失會大幅度削弱葡萄糖酸內(nèi)酯為碳源時纖維素酶的表達(dá)水平,初步試驗證明這與Stp1的轉(zhuǎn)運活性有關(guān)。本論文發(fā)現(xiàn)了里氏木霉中第一個纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白Stp1并首次報道了纖維素酶表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵類纖維二糖轉(zhuǎn)運蛋白Crtl,這為后續(xù)的纖維素酶表達(dá)調(diào)控過程中碳源感應(yīng)的研究提供了良好的開端。綜合以上結(jié)果初步得到以下模型：環(huán)境中的纖維素類底物,在本底表達(dá)的纖維素酶作用下釋放微量的纖維二糖,這些纖維二糖與定位于細(xì)胞膜上的Crtl相結(jié)合后形成的纖維素酶誘導(dǎo)信號經(jīng)下游信號途徑的傳遞最終進(jìn)入細(xì)胞核激活纖維素酶的表達(dá)。Stp1是位于細(xì)胞膜上的纖維二糖／葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,其缺失突變造成最初形成的微量纖維二糖在胞外積累加強(qiáng)了Crtl參與的纖維素酶誘導(dǎo)信號的產(chǎn)生,促進(jìn)了纖維素誘導(dǎo)下纖維素酶的表達(dá)；纖維素酶表達(dá)啟動后胞外產(chǎn)生的纖維二糖一部分被轉(zhuǎn)運進(jìn)入胞內(nèi)另一部分在胞外被水解成少量的葡萄糖,Stp1的缺失抑制了葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運也相應(yīng)抑制了葡萄糖阻遏效應(yīng)的發(fā)生,因此一定程度上促進(jìn)了纖維素酶的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：里氏木霉 纖維素 纖維素酶 轉(zhuǎn)運蛋白 類轉(zhuǎn)運蛋白 碳源感應(yīng) 葡萄糖酸內(nèi)酯
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 摘要7-11
• Abstract11-16
• 縮略詞16-17
• 第一章 緒論17-34
• 1.1 纖維素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)17
• 1.2 纖維素降解微生物17-19
• 1.2.1 纖維素降解細(xì)菌18
• 1.2.2 纖維素降解古菌18
• 1.2.3 纖維素降解真菌18-19
• 1.3 里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)19-22
• 1.3.1 里氏木霉纖維素酶系組成19-20
• 1.3.2 里氏木霉纖維素酶的表達(dá)調(diào)控20-22
• 1.4 真核生物碳源感應(yīng)受體蛋白分類22-28
• 1.4.1 轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的碳源感應(yīng)23-24
• 1.4.2 無轉(zhuǎn)運活性的類轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的碳源感應(yīng)24-25
• 1.4.3 G-蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的碳源感應(yīng)25-26
• 1.4.4 碳源感受器之間的關(guān)系26-28
• 1.5 碳源感應(yīng)在里氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)過程中的作用28-32
• 1.5.1 纖維素酶誘導(dǎo)型碳源28-29
• 1.5.2 纖維素酶誘導(dǎo)假說29
• 1.5.3 參與纖維素酶表達(dá)的碳源感應(yīng)系統(tǒng)的研究29-32
• 1.6 立題依據(jù)及研究內(nèi)容32-34
• 第二章 里氏木霉纖維二糖和乳糖轉(zhuǎn)運蛋白的篩選34-52
• 2.1 材料和方法35-41
• 2.1.1 菌種和質(zhì)粒35
• 2.1.2 引物35-37
• 2.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件37
• 2.1.4 菌種保藏37-38
• 2.1.5 實驗步驟38-41
• 2.2 結(jié)果與討論41-50
• 2.2.1 纖維二糖/乳糖轉(zhuǎn)運蛋白篩選系統(tǒng)受體菌的構(gòu)建41-43
• 2.2.2 纖維二糖/乳糖轉(zhuǎn)運蛋白篩選系統(tǒng)陽性對照菌株構(gòu)建43-44
• 2.2.3 候選轉(zhuǎn)運蛋白纖維二糖/乳糖轉(zhuǎn)運活性測定44-48
• 2.2.4 Tr_47710生物信息學(xué)分析48-50
• 2.3 本章小結(jié)50-52
• 第三章 里氏木霉糖轉(zhuǎn)運蛋白Stp1基因缺失菌性質(zhì)測定及機(jī)理探究52-98
• 3.1 材料和方法52-66
• 3.1.1 菌種和質(zhì)粒52
• 3.1.2 本章引物52-54
• 3.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件54
• 3.1.4 實驗步驟54-66
• 3.2 結(jié)果與討論66-95
• 3.2.1 里氏木霉糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因stp1敲除質(zhì)粒的構(gòu)建66-67
• 3.2.2 糖轉(zhuǎn)運蛋白基因stp1的敲除67-69
• 3.2.3 糖轉(zhuǎn)運蛋白Stp1基因缺失菌生長測定69-70
• 3.2.4 △stp1菌株纖維素酶活及Cbh Ⅰ表達(dá)測定70-72
• 3.2.5 △stp1菌株纖維素酶相關(guān)編碼基因轉(zhuǎn)錄檢測72-73
• 3.2.6 Stp1缺失對纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的影響73-75
• 3.2.7 Stp1缺失對纖維二糖代謝和轉(zhuǎn)運的影響75-78
• 3.2.8 Bgl1對△stp1菌株響應(yīng)纖維二糖的影響78-82
• 3.2.9 Bgl1對△stp1菌株纖維素降解的影響82-84
• 3.2.10 Stp1對纖維素酶誘導(dǎo)過程中葡萄糖阻遏的影響84-86
• 3.2.11 與Stp1相互作用蛋白的篩選86-95
• 3.3 本章小結(jié)95-98
• 第四章 里氏木霉Stp1缺失突變株表達(dá)譜分析98-112
• 4.1 材料和方法98-101
• 4.1.1 菌種98-99
• 4.1.2 本章引物99
• 4.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件99
• 4.1.4 實驗方法99-100
• 4.1.5 基因表達(dá)水平研究100-101
• 4.2 結(jié)果與討論101-110
• 4.2.1 送測RNA樣品的純度和濃度檢測結(jié)果101-102
• 4.2.2 表達(dá)譜測序質(zhì)量分析102-103
• 4.2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計103-108
• 4.2.4 Tr_3405轉(zhuǎn)錄上調(diào)驗證108-109
• 4.2.5 Tr_3405生物信息學(xué)分析109-110
• 4.3 本章小結(jié)110-112
• 第五章 Tr_3405的基因敲除及其對纖維素酶表達(dá)的影響112-136
• 5.1 材料和方法112-116
• 5.1.1 菌種和質(zhì)粒112-113
• 5.1.2 本章引物113-114
• 5.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件114
• 5.1.4 實驗方法114-116
• 5.2 結(jié)果與討論116-133
• 5.2.1 里氏木霉中Tr_3405的過表達(dá)116-118
• 5.2.2 Tr_3405在里氏木霉中的敲除118-120
• 5.2.3 Tr_3405缺失突變株表型測定120-127
• 5.2.4 △crt1菌株中Xyr1的表達(dá)分析127-128
• 5.2.5 Crt1相互作用蛋白pull-down釣取128-133
• 5.3 纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中碳源感應(yīng)模型133-135
• 5.4 本章小結(jié)135-136
• 第六章 一種新型纖維素酶誘導(dǎo)碳源—葡萄糖酸內(nèi)酯136-147
• 6.1 材料和方法136-138
• 6.1.1 菌種136-137
• 6.1.2 引物137
• 6.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件137-138
• 6.1.4 實驗方法138
• 6.2 結(jié)果和討論138-145
• 6.2.1 葡萄糖酸內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)里氏木霉纖維素酶表達(dá)138-139
• 6.2.2 葡萄糖酸內(nèi)酯可以作為碳源供里氏木霉生長139-140
• 6.2.3 葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)需要Xyr1和Crt1的存在140-142
• 6.2.4 Cel1a在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)過程起到至關(guān)重要的作用142-143
• 6.2.5 葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)受糖轉(zhuǎn)運蛋白Stp1影響143-145
• 6.2.6 葡萄糖酸內(nèi)醋誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)模型145
• 6.3 本章小結(jié)145-147
• 全文總結(jié)及展望147-149
• 參考文獻(xiàn)149-160
• 致謝160-161
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文161-162
• 附件162-181
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表181

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本文編號：522911