本文關鍵詞：非洲豬瘟病毒實驗室診斷技術研究及試劑儲備

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【摘要】：非洲豬瘟(Afican swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的豬的一種急性、高度致死性傳染病。1921年,ASF最初發(fā)現(xiàn)于肯尼亞,上世紀五、六十年代在非洲、歐洲、南美洲流行。近幾年來ASF流行范圍有擴大趨勢,已傳播到格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯聯(lián)邦等我國周邊國家,使我國養(yǎng)豬業(yè)面臨嚴重威脅。由于ASFV感染機制復雜,目前沒有疫苗用于防疫,因此快速、準確的診斷是控制該病傳播和發(fā)生的關鍵。我國為ASF非疫區(qū)國家,國際參考實驗室的一些診斷方法及試劑不僅來源有限、價格昂貴,而且不完全適合國內(nèi)使用,因此開展相關ASF診斷技術研究并儲備一定診斷試劑顯得尤為必要。為此,本研究建立了ASFV核酸擴增納米金檢測、抗體檢測間接ELISA以及膠體金快速檢測試紙條,這對我國ASF防控具有重要意義。1.ASFV核酸納米金擴增方法的建立根據(jù)22株ASFV p72基因序列比對分析結(jié)果,選擇高保守區(qū)域序列設計PCR引物和核酸雜交探針,將烷巰基修飾的探針標記上納米金顆粒,制備納米金檢測探針,并與生物素標記的捕捉探針一起加入PCR擴增的p72基因保守序列(大小651bp)進行雜交,雜交產(chǎn)物加入親和素包被的反應板,用銀染法進行信號放大,對反應條件進行系統(tǒng)優(yōu)化,檢測結(jié)果表明：雜交陽性產(chǎn)物在反應板中形成肉眼可見的黑色沉淀,檢測目標序列的靈敏度達到10fmol/L。為了進一步提高反應的特異性,對100株不同基因型ASFV p72基因序列進行比對分析,選擇p72基因高度保守(同源性為98%-100%)的1492-1908堿基區(qū)域為靶序列,設計通用PCR引物、捕捉探針和檢測探針各兩對,并將不同引物和探針進行組合,檢測結(jié)果顯示：雙重PCR及探針組合的檢測靈敏度可達到1 fmol/L。用建立的通用PCR引物、生物素標記的探針以及納米金標記探針檢測11株ASFV p72基因,同時設立豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬瘟病毒(CSFV)以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)對照,檢測結(jié)果顯示：不同基因型的11株ASFV核酸均為檢測陽性,而PRV、PPV、PCV-2、CSFV和PRRSV核酸均為檢測陰性,表明建立的ASFV核酸納米金擴增法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。為了進一步驗證核酸納米金擴增法檢測組織細胞中ASFV的效果,以PRV Bartha K61基因組為模板,PCR擴增的TK基因同源臂以及GFP報告基因和ASFV p72基因表達盒,構(gòu)建重組BAC轉(zhuǎn)移載體,與PRV Bartha K61株基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細胞,經(jīng)過多輪挑選熒光斑,獲得了重組病毒rPRV-p72resc;以104TCID50劑量的重組病毒滴鼻感染ICR小鼠,24h后撲殺實驗小鼠,提取心、肝、脾、肺、腎、腦、血液、小腸、肌肉等組織DNA,用建立的ASFV核酸納米金擴增法檢測p72靶基因,并用PCR方法進行驗證,結(jié)果顯示：兩種檢測方法的結(jié)果相符,提示建立的ASFV核酸納米金擴增檢測方法可用于感染組織中ASFV核酸的檢測。2.檢測ASFV抗體間接ELISA的建立為了獲得用于ASFV抗體檢測的重組抗原,分別將免疫原性強且序列保守的ASFV pA104R、pB602R、p54和pK205R基因插入原核表達載體pET-30a,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-A104R、pET30a-B602L、pET30a-p54和pET30a-K205R轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌,IPTG誘導表達后,SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物,重組菌能表達預期大小的19KDa、75KDa、 21 KDa、25KDa重組蛋白。用鎳柱親和層析法純化四種重組蛋白,以ASFV陽性血清進行Western-blotting檢測,結(jié)果顯示,四種重組蛋白均能與ASFV抗體發(fā)生特異性反應。用上述四種重組蛋白檢測ASFV感染后不同時間的豬血清,發(fā)現(xiàn)pB602R、p54和pK205R具有較好的檢測效果,在此基礎上建立了多抗原檢測ASFV抗體的間接ELISA (MA-ELSA),用該方法檢測實驗性感染ASFV的豬血清,其特異性為92.1%(95% CI,85.0%-96.5%),敏感性為98.2%(95% CI,93.8%-99.8%)；與OIE驗證的ELISA (OIE-ELISA)以及兩個商品化的ELISA試劑盒(ID Vet-ELISA、Ingenasa-ELISA)相比,120份Western blotting驗證過的血清中,MA-ELISA符合率為93.3%(κ=0.86), OIE-ELISA符合率為88.3%(κ=0.74), Ingenasa-ELISA符合率為84.2%(κ=0.64), ID Vet-ELISA符合率只有66.7%(κ=0.18),分析MA-ELISA高符合率的原因,發(fā)現(xiàn)該檢測方法能有效檢測弱陽性的ASFV抗體。檢測來自剛果的48份ASFV抗體陽性血清,結(jié)果進一步證實了MA-ELISA高準確性的特點。由此可見,建立的MA-ELISA檢測效果良好,可替代傳統(tǒng)的ASF血清學診斷方法。3. ASFV抗體膠體金快速診斷方法的建立用純化的ASFV p54重組蛋白肌肉注射健康豬,每隔一周免疫一次,在第三次免疫后第7天采血分離血清,經(jīng)間接ELISA檢測證明抗體滴度達到105-6。在最適抗原用量為5μg、最佳標記pH為pH8.0條件下,用重組蛋白p54標記膠體金顆粒吸附玻璃纖維膜,以0.2mg/mL葡萄球菌A蛋白和1mg/mL抗p54多抗分別噴涂硝酸纖維素膜作為檢測線和質(zhì)控線,按照一定的順序組裝成試紙條,建立了快速檢測ASFV抗體的膠體金間接免疫層析方法。經(jīng)檢測,該試紙與CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2抗體陽性豬血清無交叉反應,檢測敏感性和特異性良好；對141份豬血清比對檢測發(fā)現(xiàn),在ASFV感染早期,膠體金試紙優(yōu)于OIE推薦的間接ELISA檢測方法；以Western blotting檢測方法作為參照,該試紙條檢測疫區(qū)臨床陽性樣品的符合率更高。這表明本研究建立的ASFV抗體免疫層析檢測方法具有特異、敏感等特點,在將來ASF防控上具有很好的應用前景。
【關鍵詞】：非洲豬瘟病毒 核酸納米金擴增 重組偽狂犬病毒 重組抗原 間接ELISA 膠體金免疫層析
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-11
• 縮寫說明11-13
• 第一部分 非洲豬瘟研究進展(綜述)13-36
• 1 病原分類13
• 2 病毒結(jié)構(gòu)與病毒基因組13-14
• 3 病毒基因組編碼的蛋白14-20
• 4 病毒復制20-21
• 5 流行現(xiàn)狀與傳播特點21-24
• 6 ASF診斷24-27
• 7 傳入我國風險及控制策略27-29
• 參考文獻29-36
• 第二部分 非洲豬瘟病毒核酸納米金擴增方法的建立36-54
• 1 材料與方法36-42
• 2 結(jié)果42-51
• 3 討論51-52
• 參考文獻52-54
• 第三部分 表達ASFV p72基因重組偽狂犬病毒構(gòu)建及其在納米金擴增中的應用54-71
• 1 材料與方法55-61
• 2 結(jié)果61-67
• 3 討論67-68
• 參考文獻68-71
• 第四部分 非洲豬瘟病毒重組抗原的表達、純化及抗體檢測ELISA的建立71-90
• 1 材料與方法71-76
• 2 結(jié)果76-86
• 3 討論86-87
• 參考文獻87-90
• 第五部分 檢測ASFV抗體膠體金免疫層析法的建立90-101
• 1 材料與方法90-95
• 2 結(jié)果95-98
• 3 討論98-99
• 參考文獻99-101
• 全文總結(jié)101-102
• 致謝102-103
• 攻讀學位期間發(fā)表論文及申報的專利103-104

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本文編號：515486