本文關(guān)鍵詞：araf通過不同信號(hào)通路的介導(dǎo)調(diào)控胚胎早期的胚層形成，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊椎動(dòng)物的胚胎在發(fā)育過程中會(huì)形成三個(gè)具有不同發(fā)育命運(yùn)的胚層。胚層的分化涉及諸多調(diào)控因子和信號(hào)通路的精密調(diào)節(jié)。Nodal信號(hào)和FGF信號(hào)對(duì)于中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)和背腹體軸的建立具有十分重要的調(diào)控作用。這兩條信號(hào)通路也相互作用,相互調(diào)節(jié)以確保胚胎在發(fā)育過程中具有合適的信號(hào)強(qiáng)度。本課題主要研究了araf基因?qū)Π唏R魚胚胎早期胚層分化的調(diào)控作用,以及在這一過程中araf基因通過其不同異構(gòu)體調(diào)節(jié)Nodal和FGF信號(hào)通路的分子機(jī)制。本課題首先探究了Araf激酶在斑馬魚胚胎胚層分化中的作用。敲低araf能促進(jìn)中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)和背部組織的形成。遺傳互作的實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)全長araf mRNA能拮抗激活的Nodal信號(hào)所導(dǎo)致的各胚層標(biāo)記基因的表達(dá)變化。此外,Araf對(duì)中內(nèi)胚層的抑制作用不依賴于其下游Erk的介導(dǎo)。與此同時(shí),一系列在體外細(xì)胞系中的生化實(shí)驗(yàn)揭示,Araf通過直接磷酸化Smad2調(diào)控Nodal/Smad2信號(hào)。至此,本課題發(fā)現(xiàn)了Raf調(diào)控Nodal/Smad2信號(hào)的一個(gè)新途徑。araf基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄本通過選擇性多聚腺苷酸化產(chǎn)生異構(gòu)體—araf tv2,其翻譯產(chǎn)物缺失C-端激酶活性區(qū)。araf tv2的表達(dá)量隨著早期胚胎的發(fā)育逐漸升高。過表達(dá)araf tv2將導(dǎo)致胚胎的發(fā)育出現(xiàn)異常,并導(dǎo)致中胚層、內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層的標(biāo)記基因出現(xiàn)明顯下調(diào),而使表皮外胚層的標(biāo)記基因出現(xiàn)明顯上調(diào)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Araf tv2能直接結(jié)合全長Araf,但是卻不拮抗全長Araf對(duì)TGF-β/Smad2信號(hào)的抑制作用。Araf tv2能有效地抑制FGF/MAPK信號(hào),并在胚胎中拮抗過表達(dá)FGF配體所導(dǎo)致的下游Erk激活以及相應(yīng)各胚層標(biāo)記基因的表達(dá)變化。從機(jī)制上來看,Araf tv2能與Ras蛋白發(fā)生直接的相互作用,并競爭性地拮抗Ras與Raf蛋白的結(jié)合,從而阻礙了Ras-Raf-Mek-Erk通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在胚胎中過表達(dá)araf tv2能有效拮抗過表達(dá)激活型Ras所導(dǎo)致的Erk激活以及相應(yīng)各胚層標(biāo)記基因的表達(dá)變化。最后,Araf tv2對(duì)FGF/MAPK信號(hào)的抑制作用是依賴于其與Ras蛋白的相互作用。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)了Ras-Raf-Mek-Erk級(jí)聯(lián)反應(yīng)與Noda/Smad2信號(hào)之間相互作用的又一關(guān)鍵基因—araf。araf基因通過其不同的異構(gòu)體分別作用于Nodal/Smad2信號(hào)和FGF/MAPK信號(hào)通路,參與調(diào)控斑馬魚胚胎早期的胚層分化。
【關(guān)鍵詞】：araf Nodal/Smad2 FGF/MAPK 斑馬魚 胚層分化
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q954.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-47
• 1.1. 斑馬魚的胚胎發(fā)育過程10-16
• 1.1.1. 斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢11-12
• 1.1.2. 斑馬魚胚胎的發(fā)育過程12-16
• 1.2. 胚胎發(fā)育過程中的圖式形成16-27
• 1.2.1. 胚胎三個(gè)胚層的形成與發(fā)育命運(yùn)17
• 1.2.2. 胚胎中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)17-24
• 1.2.3. 胚胎背腹軸線的建立24-27
• 1.3. Nodal信號(hào)通路27-33
• 1.3.1. Nodal通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)28-31
• 1.3.2. 調(diào)控Nodal信號(hào)通路的相關(guān)因子31-32
• 1.3.3. Nodal信號(hào)在胚胎發(fā)育中的重要作用32-33
• 1.4. 成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）信號(hào)通路33-40
• 1.4.1. FGF家族成員33-34
• 1.4.2. FGF通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)34-37
• 1.4.3. 調(diào)控FGF信號(hào)通路的相關(guān)因子37-38
• 1.4.4. FGF信號(hào)在胚胎發(fā)育中的重要作用38-40
• 1.5. Raf家族蛋白及其調(diào)控40-46
• 1.5.1. Raf蛋白結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)制40-44
• 1.5.2. Araf蛋白及其研究進(jìn)展44-46
• 1.6. 本課題的研究目的與意義46-47
• 第2章 材料與方法47-74
• 2.1. 斑馬魚胚胎的獲得與培養(yǎng)條件47
• 2.2. 實(shí)驗(yàn)相關(guān)克隆的構(gòu)建47-51
• 2.2.1. 研究使用的質(zhì)粒信息47-48
• 2.2.2. 構(gòu)建克隆的引物信息48-49
• 2.2.3. 質(zhì)粒的提取與純化49-51
• 2.3. 胚胎顯微注射51-54
• 2.3.1. 體外轉(zhuǎn)錄合成m RNA51-52
• 2.3.2. 嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸（MO）的設(shè)計(jì)與使用52-53
• 2.3.3. 胚胎顯微注射方法53-54
• 2.4. 胚胎整胚原位雜交54-58
• 2.4.1. 探針的制備54-55
• 2.4.2. 原位雜交所需材料與試劑55-57
• 2.4.3. 原位雜交方法57-58
• 2.5. 斑馬魚胚胎總RNA提取和半定量PCR58-60
• 2.5.1. 總RNA提取58-59
• 2.5.2. c DNA的制備59-60
• 2.5.3. 半定量PCR60
• 2.6. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR60-61
• 2.7. 胚胎整胚免疫熒光61-63
• 2.7.1. 整胚免疫熒光所用主要試劑61-62
• 2.7.2. 整胚免疫熒光方法62-63
• 2.8. 胚胎免疫印跡63-64
• 2.9. 細(xì)胞培養(yǎng)64-68
• 2.9.1. 細(xì)胞系的種類與相關(guān)試劑64-65
• 2.9.2. 細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇方法65-66
• 2.9.3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染66-68
• 2.10. 細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)68-69
• 2.10.1. 細(xì)胞選擇與實(shí)驗(yàn)試劑68
• 2.10.2. ARE報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法68-69
• 2.10.3. Elk-1 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法69
• 2.10.4. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析69
• 2.11. 細(xì)胞蛋白檢測的免疫印跡69-72
• 2.11.1. 實(shí)驗(yàn)試劑與材料70
• 2.11.2. 免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 2.12. 免疫共沉淀72-74
• 2.12.1. 免疫共沉淀相關(guān)試劑與材料72
• 2.12.2. 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法72-74
• 第3章 全長Araf拮抗Nodal/Smad2信號(hào)介導(dǎo)的中內(nèi)胚層誘導(dǎo)74-88
• 3.1. 全長Araf激酶抑制中內(nèi)胚層誘導(dǎo)和背部組織的形成74-79
• 3.1.1. araf基因全長轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)譜74-75
• 3.1.2. 敲低araf促進(jìn)斑馬魚胚胎中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)75-78
• 3.1.3. 過表達(dá)全長araf m RNA抑制中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)78-79
• 3.1.4. 小結(jié)79
• 3.2. 全長Araf拮抗Nodal/Smad2信號(hào)以抑制中內(nèi)胚層誘導(dǎo)79-84
• 3.2.1. 全長Araf拮抗胚胎中Nodal信號(hào)過表達(dá)引起的發(fā)育異常80-81
• 3.2.2. 敲低araf部分挽救抑制Nodal導(dǎo)致的發(fā)育缺陷81-83
• 3.2.3. 全長Araf對(duì)Nodal信號(hào)的拮抗作用不依賴于下游的Erk83-84
• 3.2.4. 小結(jié)84
• 3.3. 本章總結(jié)及討論84-88
• 第4章 Araftv2拮抗FGF/MAPK信號(hào)調(diào)控胚胎的胚層分化88-123
• 4.1. Araftv2調(diào)控斑馬魚胚胎早期的胚層分化88-92
• 4.1.1. araf tv2在斑馬魚胚胎中的時(shí)空表達(dá)譜89-91
• 4.1.2. 過表達(dá)araf tv2導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)發(fā)育異常91-92
• 4.1.3. 小結(jié)92
• 4.2. Araftv2不拮抗全長Araf對(duì)TGF-β/Smad2信號(hào)的抑制作用92-99
• 4.2.1. Araftv2能與Araf tv1蛋白結(jié)合93-94
• 4.2.2. Araftv2不拮抗全長Araf對(duì)TGF-β/Smad2信號(hào)的抑制作用94-98
• 4.2.3. 小結(jié)98-99
• 4.3. Araftv2在細(xì)胞系中和胚胎中拮抗FGF/MAPK通路99-106
• 4.3.1. Araftv2抑制FGF/MAPK信號(hào)活性99-101
• 4.3.2. Araftv2拮抗胚胎中激活的FGF/MAPK信號(hào)101-103
• 4.3.3. Araftv2拮抗胚胎中過表達(dá)FGF所導(dǎo)致的標(biāo)記基因改變103-106
• 4.3.4. 小結(jié)106
• 4.4. Araftv2通過作用于Ras抑制FGF/MAPK信號(hào)活性106-118
• 4.4.1. Araftv2與Ras直接相互作用106-108
• 4.4.2. Araftv2拮抗Ras介導(dǎo)的FGF/MAPK信號(hào)活性108-114
• 4.4.3. Araftv2特異地作用于Ras水平來抑制FGF/MAPK信號(hào)114-116
• 4.4.4. 小結(jié)116-118
• 4.5. Araftv2抑制FGF/MAPK信號(hào)依賴于其與Ras的互作118-122
• 4.6. 本章總結(jié)及討論122-123
• 第5章 討論與展望123-130
• 5.1. 本課題的結(jié)論與模型123-124
• 5.2. Raf蛋白對(duì)于中內(nèi)胚層發(fā)育的調(diào)控作用124-125
• 5.3. araf基因表達(dá)的調(diào)控125-127
• 5.4. Araftv2對(duì)TGF-β/Smad2信號(hào)的抑制作用127
• 5.5. Araftv2對(duì)Ras蛋白的特異作用127-129
• 5.6. 斑馬魚Raf蛋白對(duì)FGF信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)129-130
• 參考文獻(xiàn)130-144
• 致謝144-146
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果146

  本文關(guān)鍵詞：araf通過不同信號(hào)通路的介導(dǎo)調(diào)控胚胎早期的胚層形成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：405412