為了改善蠶絲的機械性,本研究以piggy Bac轉(zhuǎn)座子載體為骨架,構(gòu)建了含有家蠶絲素重鏈蛋白的N-端區(qū)域(NTD)-綠色熒光蛋白(e GFP)-蜘蛛絲蛋白[A2S8]28-重鏈蛋白的C-端區(qū)域(CTD)融合基因表達元件的打靶載體p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD,同時根據(jù)絲素重鏈基因內(nèi)含子區(qū)域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列,設(shè)計組裝了TALENs序列,構(gòu)建了靶向絲素重鏈基因內(nèi)含子區(qū)域的TALEN 9-10載體;SURVEYOR和lac Z中斷法證實TALEN 9-10載體在家蠶卵母細胞株(Bm N cells)中的效率約為13.95%。將TALEN 9-10載體與打靶載體p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD混合,通過真空電穿孔技術(shù),導(dǎo)入家蠶初產(chǎn)卵,篩選獲得G0代轉(zhuǎn)基因家蠶。PCR檢測結(jié)果顯示,G0代轉(zhuǎn)基因家蠶蠶蛾基因組中有報告基因e GFP(enhance green fluorescence protein gene)的存在;Western Dot Blot檢測轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭蛋白樣品,證實轉(zhuǎn)基因家蠶表達...

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 綜述
    1 轉(zhuǎn)基因家蠶的研究
        1.1 家蠶轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)的構(gòu)建與發(fā)展
        1.2 外源基因?qū)爰倚Q方法
        1.3 利用家蠶生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白
    2 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展及現(xiàn)狀
    參考文獻
第二章 研究目的與研究內(nèi)容
    1 研究目的與意義
    2 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
        2.1 主要研究內(nèi)容
        2.2 研究技術(shù)路線
第三章 常用實驗材料與方法
    1 常用儀器
    2. 常用的實驗方法
        2.1 DNA的連接反應(yīng)體系
        2.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.3 小劑量抽取質(zhì)粒DNA的方法(QIAGEN Mini-preps)
        2.4 質(zhì)粒DNA的中量提取
        2.5 DNA的酶切反應(yīng)體系
        2.6 家蠶基因組DNA提取
        2.7 目的片段的分離和回收
        2.8 PCR產(chǎn)物的純化
        2.9 PCR擴增目的片段
        2.10 瓊脂糖凝膠電泳
        2.11 細胞的培養(yǎng)和保存
        2.12 BmN細胞基因組的抽提方法
第四章TALENs質(zhì)粒的構(gòu)建及其效率在細胞中的檢測
    摘要
    1 引言
    2. 材料與方法
        2.1 TALENs的設(shè)計
        2.2 TALENs的構(gòu)建
        2.3 將構(gòu)建好的pTAL3- TALEN(9-10) 載體改造為pIE-TALEN(9-10) 載體
        2.4 SURVEYOR核酸酶檢測TALEN(9-10)在BmN細胞中的作用效率
        2.5 Lac Z中斷法檢測TALEN (9-10) 在BmN細胞中的切割特異性
    3 結(jié)果與分析
        3.1 pTAL3-TALEN(9-10)質(zhì)粒的鑒定
        3.2 pIE-TALEN(9-10) 載體的構(gòu)建
        3.3 SURVEYOR核酸酶檢測pIE-TALEN (9-10)剪切效率
        3.4 lacZ中斷法檢測p IE-TALEN(9-10)切割特異性
    4 討論
    參考文獻
第五章 轉(zhuǎn)蜘蛛絲蛋白基因的供體質(zhì)粒pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的構(gòu)建
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 pXL-BACII-MCS的構(gòu)建
        2.2 蠶絲重鏈C-段(CTD)的裝配
        2.3 蜘蛛絲基因Spider[A2S8]28的裝配
        2.4 重鏈蛋白的N-端部分(NTD)和eGFP的裝配
    3 結(jié)果與分析
        3.1 pXL-BACII-MCS的鑒定
        3.2 pXL-BACII-CTD的鑒定
        3.3 Spider[A2S8]28的裝配及pIEx1Spider的鑒定
        3.4 pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的鑒定
    參考文獻
第六章 轉(zhuǎn)基因家蠶的制作、篩選與鑒定
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 真空電穿孔法將質(zhì)粒導(dǎo)入初產(chǎn)卵
        2.2 電穿孔處理蠶卵的檢測
        2.3 定性檢測轉(zhuǎn)基因蠶繭及蠶繭蛋白
        2.4 ELISA定量檢測蛛絲蛋白的水平
        2.5 轉(zhuǎn)基因家蠶的鑒定
        2.6 反向PCR檢測外源基因在家蠶基因組中的定位
    3 結(jié)果與分析
        3.1 電穿孔處理家蠶蠶卵的熒光觀察與PCR檢測
        3.2 G0 代轉(zhuǎn)基因蠶繭的熒光觀察與表達產(chǎn)物檢測
    4 討論
    參考文獻
第七章 轉(zhuǎn)基因家蠶蠶絲機械性能的檢測
    摘要
    1 引言
    2. 材料與方法
        2.1 蠶絲機械性能的測試具體方法
        2.2 數(shù)據(jù)分析
    3. 結(jié)果與分析
        3.1 轉(zhuǎn)基因蠶絲的最大極限拉力和最大彈性應(yīng)力
        3.2 轉(zhuǎn)基因蠶絲A-D組機械性能指標對比
    4 討論
    參考文獻
第八章 G1 代轉(zhuǎn)基因家蠶絲的機械性能研究
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭的傳代、分組及轉(zhuǎn)基因蠶絲蛋白中eGFP含量的檢測
        2.2 繭絲的機械性能的測定方法
    3 結(jié)果與分析
        3.1 G1 代轉(zhuǎn)基因家蠶繭絲蛋白中eGFP含量的測定
        3.2 轉(zhuǎn)基因繭絲的機械性能
    4 討論
    參考文獻
結(jié)論與創(chuàng)新點
資助項目
附錄
    附件一TALENs (9-10)的相關(guān)DNA序列
    附錄二pTAL3 載體DNA序列
    附件三pBR322-lac Z載體的DNA序列
    附件四TALENs (9-10)在靶定位點作用效率檢測相關(guān)測序結(jié)果
    附件五pXL-BACⅡ-NTD-eGFP-Spider[A2S8]28-NTD載體序列
    附件六Piggybac染色體定位DNA序列測序結(jié)果
    附件七G1 中的轉(zhuǎn)基因家蠶繭絲機械性能數(shù)據(jù)匯總
致謝



本文編號：3967341