2015-2016年,寨卡病毒在全球范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)流行,暴露出該病毒感染與特定神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生率增加有關,比如先天性寨卡綜合征(含小頭癥)和成人格林-巴利綜合征。然而,造成寨卡病毒神經(jīng)感染性增強的因素仍然不確定。我們假設,寨卡病毒在感染神經(jīng)系統(tǒng)時,部分病毒基因組發(fā)生適應性突變,可能增強了病毒對神經(jīng)系統(tǒng)的感染性。由于寨卡病毒可以感染野生型新生小鼠,并可導致類似小頭癥、癱瘓和癲癇發(fā)作的神經(jīng)性疾病;而這些神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)與新生小鼠神經(jīng)元祖細胞和其他神經(jīng)細胞的寨卡感染有關,所以,我們認為新生乳鼠可以作為研究寨卡病毒遺傳特征如何對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機制產(chǎn)生影響的實驗模型。為了驗證假設,我們在新生乳鼠大腦中將寨卡病毒2016年臨床分離株SW01連續(xù)傳播11代,獲得了適應小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的寨卡病毒MA-SW01,并發(fā)現(xiàn)該病毒在體內(nèi)的神經(jīng)毒性和復制能力顯著增強,且主要靶向區(qū)域為大腦皮層和海馬區(qū)。通過高通量測序,我們發(fā)現(xiàn)MA-SW01全基因組上有4個大于80%的高頻錯義突變,這些突變導致3個E蛋白氨基酸突變(D67N,M68I,N154D)和1個NS2A蛋白氨基酸突變(A117T)。進一步病毒反...

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
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英文摘要
第一章 引言
    1.1 寨卡病毒概述
        1.1.1 寨卡病毒的傳播途徑和流行病學
        1.1.2 寨卡病毒的基因組與分類
        1.1.3 寨卡病毒的結構
        1.1.4 寨卡病毒的生命周期
        1.1.5 寨卡病毒感染后的臨床癥狀
    1.2 寨卡病毒基因突變與其感染性的關系
    1.3 寨卡病毒神經(jīng)毒性的研究
        1.3.1 PrM蛋白進化突變論
        1.3.2 E蛋白糖基化修飾論
        1.3.3 非結構蛋白作用論
        1.3.4 ADE效應論
    1.4 利用小鼠進行寨卡病毒適應性進化研究的可行性
    1.5 寨卡病毒反向遺傳學研究
    1.6 研究寨卡病毒病理學的小鼠模型
        1.6.1 免疫缺陷成年小鼠模型
        1.6.2 免疫健全成年小鼠模型
        1.6.3 胎鼠和新生乳鼠模型
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗儀器
    2.2 實驗試劑和材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 寨卡病毒的體外擴增繁殖
        2.3.2 寨卡病毒在乳鼠顱內(nèi)的生長曲線的測定
        2.3.3 寨卡病毒在乳鼠體內(nèi)的接種傳代
        2.3.4 寨卡病毒滴度的測定
        2.3.5 寨卡病毒小鼠毒力測試
        2.3.6 組織器官RNA提取方法
        2.3.7 組織器官中病毒載量的測定
            2.3.7.1 cDNA合成
            2.3.7.2 實時定量PCR(qPCR)
        2.3.8 免疫熒光檢測腦組織病毒感染
        2.3.9 寨卡病毒高通量測序與分析
        2.3.10 單克隆病毒的挑選與擴增
        2.3.11 單克隆病毒E蛋白核酸序列的測定
        2.3.12 反向遺傳學構建定點突變寨卡病毒
        2.3.13 免疫熒光檢測細胞感染
        2.3.14 病毒遺傳穩(wěn)定性體外檢測
        2.3.15 寨卡病毒和登革熱病毒E蛋白序列的多重比較
        2.3.16 寨卡病毒糖基化檢測
        2.3.17 流式細胞技術定量感染細胞
        2.3.18 統(tǒng)計分析方法
    2.4 倫理聲明
第三章 實驗結果
    3.1 建立寨卡病毒感染乳鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒傳代模型
    3.2 小鼠CNS適應性寨卡病毒MA-SW01 展現(xiàn)出病毒毒力增強特征
    3.3 MA-SW01 可以在乳鼠大腦中建立復制優(yōu)勢
    3.4 MA-SW01 的主要靶向區(qū)域是大腦的海馬區(qū)和皮層區(qū)
    3.5 從MA-SW01 病毒株分離出的單克隆病毒即具有毒力增強的表型
    3.6 高通量測序發(fā)現(xiàn)MA-SW01 產(chǎn)生4 個高頻錯義突變
    3.7 構建含E蛋白突變和NS2A突變的感染性克隆病毒
    3.8 E蛋白67-68 位的連續(xù)突變對病毒毒力增強至關重要
    3.9 測序分析顯示E蛋白67 位點是潛在的毒力決定位點
    3.10 E蛋白67 位點是病毒毒力增強決定位點
    3.11 E蛋白68 位點突變對維持病毒67 位點突變穩(wěn)定性不是必要條件
    3.12 E蛋白67 位點突變沒有形成經(jīng)典的糖基化功能
    3.13 E蛋白67 位點突變增強了病毒在乳鼠大腦中的復制能力
    3.14 E蛋白67 位點的替代突變可能是病毒在CNS的適應性結果
第四章 總結與討論
    4.1 課題結論與潛在意義
    4.2 課題設計的不足之處
    4.3 課題研究的重點展望
參考文獻
略縮語
作者簡歷
代表性文章
專業(yè)綜述
    References
致謝



本文編號：3860189