蛋白合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和生存過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成過(guò)程受到嚴(yán)格的調(diào)控。蛋白翻譯失調(diào)被認(rèn)為是腫瘤的特征之一。蛋白翻譯起始是整個(gè)蛋白合成的限速步驟,而eIF4F復(fù)合物參與的43S復(fù)合物的裝配是蛋白翻譯起始的限速步驟,所以eIF4F復(fù)合物的調(diào)控對(duì)于整個(gè)蛋白翻譯的效率的調(diào)節(jié)起著重要的作用,因此eIF4F復(fù)合物通常被作為腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)。eIF4F復(fù)合物主要由eIF4A、eIF4E和eIF4G組成,其中eIF4E的調(diào)控機(jī)制及藥物靶點(diǎn)研究較為成熟,而eIF4A和eIF4G的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步被闡明。O-GlcNAc糖基化修飾是通過(guò)β-D-N-乙酰葡糖胺共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上的一種細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯后修飾。目前已發(fā)現(xiàn)鑒定1000多種具有O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白,越來(lái)越多的證據(jù)表明,O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)節(jié)各種重要的生物學(xué)過(guò)程,包括轉(zhuǎn)錄、干細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)程和代謝重編程等。O-GlcNAc糖基化紊亂能夠?qū)е翴I型糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、阿爾茲海默氏病、腫瘤等多種重大疾病的發(fā)生。過(guò)去幾年的研究表明O-GlcNAc糖基化修飾能夠直接或間接調(diào)...

【文章頁(yè)數(shù)】：126 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
縮寫(xiě)對(duì)照表
第一章 綜述
    1.1 蛋白翻譯起始概述
        1.1.1 蛋白質(zhì)生物合成
        1.1.2 蛋白翻譯起始
        1.1.3 蛋白翻譯起始因子
        1.1.4 eIF4F復(fù)合物
        1.1.5 eIF4F復(fù)合物的調(diào)控
        1.1.6 eIF4F復(fù)合物的失調(diào)與腫瘤
        1.1.7 eIF4F復(fù)合物可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)
    1.2 O-GlcNAc糖基化修飾概述
        1.2.1 HBP途徑與營(yíng)養(yǎng)感受器
        1.2.2 OGA與 OGT
        1.2.3 O-GlcNAc糖基化修飾與腫瘤
        1.2.4 O-GlcNAc糖基化修飾作為腫瘤治療的靶點(diǎn)
立題依據(jù)和意義
第二章 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)控蛋白合成機(jī)制
    2.1 材料與方法
        2.1.1 核酸序列
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 主要緩沖液配方
        2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與腫瘤組織
        2.1.5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.6 eIF4G1和e IF4A基因突變表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.1.7 shRNA載體的構(gòu)建
        2.1.8 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        2.1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.1.10 慢病毒的制備及細(xì)胞感染
        2.1.11 蛋白表達(dá)與純化
        2.1.12 Western Blot
        2.1.13 O-GlcNAc糖基化修飾的檢測(cè)
        2.1.14 細(xì)胞內(nèi)蛋白合成測(cè)定
        2.1.15 體外蛋白合成測(cè)定
        2.1.16 多核糖體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.1.17 eIF4AI的解螺旋酶活性測(cè)定
        2.1.18 m7GDP親和層析實(shí)驗(yàn)
        2.1.19 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        2.1.20 軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)
        2.1.21 裸鼠移植瘤形成實(shí)驗(yàn)
        2.1.22 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 OGT能與細(xì)胞內(nèi)的e IF4F復(fù)合物相互作用
        2.2.2 eIF4F復(fù)合物中的e IF4AI和 eIF4GI存在O-GlcNAc糖基化修飾
        2.2.3 eIF4AI是在細(xì)胞蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮主要功能的eIF4A基因剪接體
        2.2.4 eIF4AI的糖基化修飾受細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)動(dòng)態(tài)調(diào)控
        2.2.5 腫瘤細(xì)胞中的eIF4AI的糖基化水平降低
        2.2.6 eIF4AI的絲氨酸322 位和323 位是主要的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)
        2.2.7 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾干擾了eIF4F復(fù)合物的裝配
        2.2.8 提高e IF4AI的 O-GlcNAc糖基化抑制了eIF4AI與 eIF4GI的互作
        2.2.9 細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)影響了eIF4AI與 eIF4GI的互作
        2.2.10 細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)影響了eIF4AI與內(nèi)源的eIF4GI的互作
        2.2.11 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了其解旋酶活性
        2.2.12 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制體外的蛋白合成效率
        2.2.13 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成效率
        2.2.14 構(gòu)建穩(wěn)定的WT、S322/S323A和 S322/S323Y的eIF4AI補(bǔ)救的A2780 細(xì)胞系
        2.2.15 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了卵巢癌細(xì)胞的繁殖
        2.2.16 eIF4AI的 O-GlcNAc糖基化修飾抑制了裸鼠中卵巢癌細(xì)胞的成瘤
        2.2.17 卵巢癌組織樣品中的OGT、OGA含量和總體的O-GlcNAc糖基化修飾檢測(cè)
        2.2.18 卵巢癌組織樣品中的eIF4AI的糖基化水平下調(diào)
    2.3 小結(jié)
第三章 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)控蛋白合成機(jī)制
    3.1 材料與方法
        3.1.1 核酸序列
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與腫瘤組織
        3.1.4 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲入
        3.1.5 熒光各向異性實(shí)驗(yàn)
        3.1.6 可剪切的蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)
        3.1.7 細(xì)胞周期同步化和流式檢測(cè)
        3.1.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
        3.1.9 MCF-7 細(xì)胞裸鼠移植瘤形成實(shí)驗(yàn)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 eIF4GI是在細(xì)胞蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮主要功能的剪接體
        3.2.2 eIF4GI的糖基化修飾受細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)動(dòng)態(tài)調(diào)控
        3.2.3 腫瘤細(xì)胞中e IF4GI的糖基化水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)
        3.2.4 S61是e IF4GI的主要O-GlcNAc糖基化修飾位點(diǎn)
        3.2.5 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了eIF4GI與內(nèi)源PABP的相互作用
        3.3.6 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾缺失抑制了eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.3.7 高糖條件培養(yǎng)促進(jìn)了內(nèi)源的eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.2.8 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了eIF4GI與 m RNA的相互作用
        3.2.9 產(chǎn)生e IF4GI S61A突變的MCF-7 細(xì)胞系
        3.2.10 MCF-7 細(xì)胞中經(jīng)TMG處理后eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化水平變化
        3.2.11 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了MCF-7 細(xì)胞內(nèi)源eIF4GI與 PABP的相互作用
        3.2.12 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的蛋白合成
        3.2.13 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了多聚核糖體的形成
        3.2.14 eIF4GI的 O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)
        3.2.15 eIF4GI的 S61 位糖基化缺失抑制了細(xì)胞的單克隆形成能力
        3.2.16 eIF4GI的 S61 位糖基化修飾促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的腫瘤形成能力
        3.2.17 乳腺癌組織樣品中的OGT的含量和總體的O-GlcNAc糖基化修飾檢測(cè)
        3.2.18 在乳腺癌組織中e IF4GI的糖基化水平升高
        3.2.19 在細(xì)胞周期進(jìn)程中,eIF4AI和 eIF4GI的糖基化修飾存在動(dòng)態(tài)變化
    3.3 小結(jié)
第四章 總結(jié)與討論
    4.1 總結(jié)
    4.2 討論
    4.3 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3843563