本文關(guān)鍵詞：基于穩(wěn)定同位素雙甲基化標(biāo)記的動(dòng)植物組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：穩(wěn)定同位素標(biāo)記的雙甲基化(Stable isotope dimethyl labeling)定量技術(shù)是一種化學(xué)標(biāo)記技術(shù),它的基本原理是在所有肽段的N端和賴氨酸的側(cè)鏈上加上一個(gè)雙甲基化標(biāo)記,通過給雙甲基引入穩(wěn)定同位素,在一級(jí)質(zhì)譜中形成一對(duì)存在質(zhì)量偏移的同位素峰。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的雙甲基化定量技術(shù)具有價(jià)格便宜,操作簡(jiǎn)單,標(biāo)記效率高的優(yōu)點(diǎn),由于其是在肽段水平標(biāo)記,所以雙甲基化標(biāo)記幾乎能應(yīng)用到任何生物學(xué)樣品中,特別是動(dòng)植物組織學(xué)樣品。在本文的第一部分工作中,我們應(yīng)用雙甲基化標(biāo)記技術(shù)比較了紅蓮雜交水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系YtA和可育系YtB線粒體的全蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)復(fù)合體組的差異。通過研究,我們發(fā)現(xiàn)紅蓮雜交水稻不育系YtA和可育系YtB中線粒體全蛋白的含量沒有顯著改變,但是線粒體中蛋白質(zhì)復(fù)合體的含量在不育系YtA中呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(shì)。經(jīng)過酶活檢測(cè)和線粒體的亞顯微結(jié)構(gòu)觀察,我們發(fā)現(xiàn)不育系YtA線粒體中呼吸鏈復(fù)合體的酶學(xué)活性顯著降低,線粒體的形態(tài)也發(fā)生了顯著改變。這些結(jié)果都表明在細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)的水稻線粒體中,線粒體蛋白的含量沒有顯著改變,但是線粒體中功能性的復(fù)合體蛋白,特別是呼吸鏈復(fù)合體蛋白的含量顯著下降,揭示細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)的水稻線粒體可能存在復(fù)合體裝配的問題。另外,我們也發(fā)現(xiàn)不育系YtA中茉莉酸生物合成通路的異常。在本文的第二部分工作中,我們應(yīng)用雙甲基化標(biāo)記技術(shù)比較了大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注(Ischemia and reperfusion, I/R)模型中的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。在全部1088個(gè)定量蛋白中,234個(gè)蛋白(～22%)表現(xiàn)出1.5倍以上的上下調(diào),其中194個(gè)蛋白上調(diào),40個(gè)蛋白下調(diào)�；驓w類(Gene Ontology, GO)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的評(píng)估表明在I/R損傷過后,代謝過程(metabolic process)相關(guān)蛋白呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),而細(xì)胞通訊(cell communication)、系統(tǒng)過程(system process)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程(transport)相關(guān)蛋白呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。這一結(jié)果暗示I/R損傷后機(jī)體表現(xiàn)出增強(qiáng)對(duì)于生存至關(guān)重要的代謝過程而減弱細(xì)胞功能性的生物學(xué)過程。通過STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,我們發(fā)現(xiàn)了顯著上調(diào)的核糖體蛋白和分泌蛋白(包含許多蛋白酶抑制劑)作用網(wǎng)絡(luò)。雖然這一結(jié)果暗示機(jī)體內(nèi)的蛋白合成呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),但是我們發(fā)現(xiàn)與蛋白合成激活相關(guān)的mTOR (mammalian target of rapamycin)通路卻是在I/R損傷之后被抑制的。在下調(diào)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中,我們發(fā)現(xiàn)了突觸相關(guān)蛋白顯著下調(diào),后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一現(xiàn)象,暗示I/R損傷之后大鼠視網(wǎng)膜存在功能性突觸的減少。在本文的第三部分工作中,我們應(yīng)用雙甲基化標(biāo)記技術(shù)比較了肝臟特異性的泛素連接酶gp78基因敲除小鼠中肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的變化。在雄性小鼠的兩組生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中,我們總共定量了3193個(gè)蛋白,其中2088個(gè)蛋白為兩組共同定量蛋白。在這2088個(gè)定量蛋白當(dāng)中,42個(gè)蛋白呈現(xiàn)出顯著的上下調(diào)(1.5倍變化)。通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)這42個(gè)蛋白中含有較多的代謝相關(guān)的酶,其中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(shì)。這一結(jié)果表明,gp78基因敲除后,小鼠肝臟中的脂質(zhì)代謝是受到抑制的。
【關(guān)鍵詞】：穩(wěn)定同位素的雙甲基化標(biāo)記 細(xì)胞質(zhì)雄性不育 復(fù)合體蛋白 茉莉酸生物合成通路 缺血再灌注 核糖體蛋白 mTOR通路 突觸相關(guān)蛋白 肝臟特異性的gp78基因敲除小鼠 脂質(zhì)代謝
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q51
【目錄】：

• 本研究主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)5-8
• 摘要8-10
• Abastract10-12
• 第一章 緒論12-25
• 1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介12-15
• 1.1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述及其發(fā)展12-13
• 1.1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的簡(jiǎn)介13-15
• 1.2 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介15-22
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)16-17
• 1.2.2 等質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記定量技術(shù)(iTRAQ和TMT)17-19
• 1.2.3 蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量技術(shù)(AQUA)19-20
• 1.2.4 無標(biāo)記定量技術(shù)(Label free)20-22
• 1.2.5 選擇性質(zhì)譜反應(yīng)監(jiān)控定量技術(shù)(SRM)22
• 1.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的雙甲基化定量技術(shù)22-25
• 第二章 基于雙甲基化定量的紅蓮雜交水稻線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究25-46
• 2.1 前言25-26
• 2.2 材料與方法26-33
• 2.2.1 材料26
• 2.2.2 水稻線粒體的提取26-27
• 2.2.3 BN-PAGE分離線粒體蛋白復(fù)合體27-28
• 2.2.4 BN-PAGE分離的線粒體蛋白復(fù)合體的膠內(nèi)酶解28
• 2.2.5 水稻線粒體總蛋白的溶液內(nèi)酶解28-29
• 2.2.6 水稻線粒體總蛋白溶液內(nèi)酶解后肽段的脫鹽29
• 2.2.7 雙甲基化標(biāo)記線粒體肽段29-30
• 2.2.8 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)分離30
• 2.2.9 QSTAR Elite質(zhì)譜分析30-31
• 2.2.10 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的搜庫(kù)及分析31
• 2.2.11 線粒體蛋白復(fù)合體的Western blots分析31
• 2.2.12 水稻線粒體呼吸鏈復(fù)合體的酶活檢測(cè)31-32
• 2.2.13 水稻線粒體形態(tài)學(xué)的電鏡檢測(cè)32
• 2.2.14 茉莉酸及其生物合成前體的定量檢測(cè)32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-44
• 2.3.1 紅蓮雜交水稻線粒體的全蛋白質(zhì)組學(xué)和復(fù)合體組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程33-35
• 2.3.2 紅蓮雜交水稻不育系和可育系的線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析35-38
• 2.3.3 線粒體中復(fù)合體蛋白含量的分析38-40
• 2.3.4 線粒體中呼吸鏈復(fù)合體蛋白的酶活檢測(cè)40
• 2.3.5 不育系YtA和可育系YtB線粒體的形態(tài)學(xué)檢測(cè)40-41
• 2.3.6 不育系YtA和可育系YtB水稻中茉莉酸合成通路的檢測(cè)41-44
• 2.3.7 ROS相關(guān)的線粒體蛋白顯著上調(diào)44
• 2.4 討論與展望44-46
• 第三章 基于雙甲基化定量的視網(wǎng)膜I/R損傷機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究46-76
• 3.1 前言46-47
• 3.2 材料與方法47-54
• 3.2.1 材料47
• 3.2.2 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷模型的建立47-48
• 3.2.3 體外細(xì)胞(SH-SY5Y)I/R損傷模型的建立48
• 3.2.4 大鼠視網(wǎng)膜蛋白和SH-SY5Y細(xì)胞蛋白的提取48
• 3.2.5 正常組和I/R處理組的大鼠視網(wǎng)膜蛋白的溶液內(nèi)酶解48-49
• 3.2.6 正常組和I/R處理組的大鼠視網(wǎng)膜蛋白溶液內(nèi)酶解后的脫鹽49-50
• 3.2.7 正常組和I/R處理組的大鼠視網(wǎng)膜蛋白的雙甲基化標(biāo)記50
• 3.2.8 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)分離雙甲基化標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜I/R樣品50-51
• 3.2.9 雙甲基化標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜I/R處理的樣品的質(zhì)譜分析51
• 3.2.10 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的搜庫(kù)及定量51
• 3.2.11 生物信息學(xué)分析51-52
• 3.2.12 Western Blots分析52-53
• 3.2.13 視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)檢測(cè)和免疫熒光染色53-54
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-73
• 3.3.1 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷前后的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析54-62
• 3.3.2 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷前后蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程(biological process)分析62-65
• 3.3.3 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷前后顯著變化蛋白的作用網(wǎng)絡(luò)分析65-68
• 3.3.4 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷模型的定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的Western blots驗(yàn)證68-70
• 3.3.5 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷誘導(dǎo)突觸相關(guān)蛋白的減少70-71
• 3.3.6 大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷誘導(dǎo)核糖體蛋白的累積和mTOR通路的抑制71-73
• 3.4 討論與展望73-76
• 第四章 基于雙甲基化定量的gp78基因敲除小鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)研究76-96
• 4.1 前言76-79
• 4.2 材料與方法79-83
• 4.2.1 材料79
• 4.2.2 正常小鼠和gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白的提取79-80
• 4.2.3 正常小鼠和gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白的溶液內(nèi)酶解80
• 4.2.4 正常組和gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白溶液內(nèi)酶解后的脫鹽80-81
• 4.2.5 正常組和gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白的雙甲基化標(biāo)記81
• 4.2.6 正常組和gp78基因敲除小鼠混合肽段的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離81-82
• 4.2.7 正常組和gp78基因敲除小鼠雙甲基化標(biāo)記的混合樣品的質(zhì)譜分析82
• 4.2.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的搜庫(kù)及定量82-83
• 4.2.9 生物信息學(xué)分析83
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果83-94
• 4.3.1 小鼠泛素連接酶gp78基因敲除效果的檢測(cè)83-84
• 4.3.2 gp78基因敲除小鼠肝臟的比較蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程84-86
• 4.3.3 gp78基因敲除小鼠肝臟的比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果86-90
• 4.3.4 gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白組學(xué)的基因歸類分析90-92
• 4.3.5 gp78基因敲除小鼠肝臟蛋白組學(xué)的STRING分析92-94
• 4.4 討論與展望94-96
• 第五章 總結(jié)及展望96-97
• 參考文獻(xiàn)97-105
• 博士期間已發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文105-106
• 致謝106

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