本文關(guān)鍵詞：代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)S-腺苷甲硫氨酸，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生物活性物質(zhì)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)廣泛存在于生物體內(nèi),參與體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和磷脂的合成與代謝,可以改善細(xì)胞代謝,對(duì)于維護(hù)細(xì)胞正常代謝必不可少。目前SAM發(fā)酵生產(chǎn)菌株主要為酵母菌,酵母的發(fā)酵周期較長(zhǎng),通常超過100 h,且發(fā)酵過程中要不斷添加前體物質(zhì)L-甲硫氨酸,同時(shí)酵母細(xì)胞膜壁較復(fù)雜,給后期提取及純化帶來困難。為克服這些缺陷,本研究探索了了利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)合成SAM的新方法。C.glutamicum可以積累SAM合成的前體物質(zhì)L-甲硫氨酸,且其基因組已經(jīng)被測(cè)序,因而通過代謝工程系統(tǒng)改造C.glutamicum生產(chǎn)SAM具有理論價(jià)值和應(yīng)用前景。本論文針對(duì)C.glutamicum野生型菌株ATCC 13032和異亮氨酸高產(chǎn)菌IWJ001進(jìn)行了一系列代謝工程改造,提高了其SAM合成水平。主要結(jié)論如下:(1)將來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、C.glutamicum、大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的SAM合成酶基因在E.coli JM109進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)現(xiàn)C.glutamicum來源的metK和S.cerevisiae來源的基因SAM2編碼的SAM合成酶活性比較高。將基因metK和SAM2分別克隆到E.coli-C.glutamicum穿梭載體pDXW-8中,并轉(zhuǎn)化C.glutamicum ATCC 13032。研究發(fā)現(xiàn)ATCC 13032/pDXW-8-metK中SAM合成酶MetK過量表達(dá),酶活為7.9 U·g-1,SAM產(chǎn)量為97 mg·L-1,是對(duì)照菌ATCC 13032/pDXW-8的5.27倍。而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2不能表達(dá)SAM2編碼的SAM2,與對(duì)照相比無酶活及SAM產(chǎn)量的提高。(2)首先針對(duì)ATCC 13032/pDXW-8-SAM2菌株,RT-PCR和SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)SAM2基因可轉(zhuǎn)錄但不能翻譯。為了在C.glutamicum正常表達(dá),通過密碼子優(yōu)化將SAM2序列優(yōu)化為SAM2C,并轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC 13032。結(jié)果顯示ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C可以過量表達(dá)SAM合成酶,酶活為2.2 U·g-1,SAM產(chǎn)量達(dá)105 mg·L-1。然后進(jìn)行了分批發(fā)酵,結(jié)果顯示ATCC 13032/pDXW-8-metK在分批補(bǔ)料發(fā)酵36 h后,SAM產(chǎn)量達(dá)316 mg·L-1;而ATCC 13032/pDXW-8-SAM2C在發(fā)酵60 h后,SAM積累達(dá)239 mg·L-1。將上述菌株的SAM合成酶MetK和SAM2C分別進(jìn)行分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果顯示MetK和SAM2C最適反應(yīng)溫度均為35 oC,最適反應(yīng)pH均為8.5,對(duì)甲硫氨酸的Km值分別為0.51和1.04 mM,對(duì)ATP的Km值分別為2.07和1.99 mM。動(dòng)力學(xué)研究表明MetK和SAM2C對(duì)ATP的親和力相差不大,但前者對(duì)甲硫氨酸的親和力比較高。(3)通過代謝工程構(gòu)建了一系列SAM高產(chǎn)菌株。首先以C.glutamicum ATCC 13032的突變菌WTQ102出發(fā)菌,通過進(jìn)一步基因敲除構(gòu)建了菌株WHQ103。WHQ103缺失了編碼McbR調(diào)控蛋白的基因mcbR、編碼高絲氨酸激酶的基因thrB和編碼胱硫醚-γ-合酶基因met B,SAM產(chǎn)量為74.3 mg·L-1。然后在WHQ103基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除編碼硫同化代謝調(diào)控酶的基因Ncgl2640,構(gòu)建了菌株WHQ104,使SAM產(chǎn)量提高到95.4 mg·L-1。最后在WHQ104中過量表達(dá)metK基因和編碼透明顫血紅蛋白的基因vgb,構(gòu)建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb;進(jìn)一步表達(dá)甲硫氨酸合成途徑上的關(guān)鍵基因metX、metY、抗反饋抑制的homm和lysCm基因,構(gòu)建了菌株WHQ104/pJYW-4-metK-vgb-metYX-homm-lysCm。發(fā)酵結(jié)果顯示W(wǎng)HQ104/pJYW-4-metK-vgb在36 h可產(chǎn)181.8 mg·L-1 SAM,而WHQ104/pJYW-4-metK-vgbmetYX-homm-lysCm在60 h可產(chǎn)SAM 180.6 mg·L-1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)針對(duì)WHQ104/pJYW-4-metK-vgb,添加甲硫氨酸不能進(jìn)一步提高SAM產(chǎn)量,表明甲硫氨酸供給已非SAM合成的限制性因素,胞內(nèi)ATP水平可能為限制SAM合成水平的重要因素。(4)通過代謝工程改造構(gòu)建L-異亮氨酸和SAM聯(lián)產(chǎn)菌株。在C.glutamicum異亮氨酸高產(chǎn)菌IWJ001中過量表達(dá)metK和vgb基因,可實(shí)現(xiàn)胞外分泌L-異亮氨酸,及胞內(nèi)積累SAM。與IWJ001/pDXW-8相比,IWJ001/pDXW-8-metK胞內(nèi)SAM產(chǎn)量提高了11.65倍,IWJ001/pDXW-8-metK-vgb胞內(nèi)SAM產(chǎn)量提高了14.95倍。進(jìn)一步表達(dá)丙酮酸激酶、蘋果酸:醌氧化酶、蘋果酸脫氫酶的編碼基因pyk、mqo、mdh,構(gòu)建菌株IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-pyk、IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mqo和IWJ001/pDXW-8-metK-vgb-mdh,但這些菌株SAM產(chǎn)量不及IWJ001/pDXW-8-metK-vgb。IWJ001/pDXW-8-metK-vgb在搖瓶發(fā)酵72 h可產(chǎn)0.55 g·L-1 SAM和4.24 g·L-1 L-異亮氨酸,分批發(fā)酵72 h,可產(chǎn)0.67 g·L-1 SAM和13.88 g·L-1 L-異亮氨酸。
【關(guān)鍵詞】：谷氨酸棒桿菌 S-腺苷甲硫氨酸 SAM合成酶 L-甲硫氨酸 代謝工程
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-21
• 1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能10-14
• 1.1.1 轉(zhuǎn)甲基作用10-11
• 1.1.2 轉(zhuǎn)硫基作用11
• 1.1.3 轉(zhuǎn)氨丙基作用11-12
• 1.1.4 S-腺苷甲硫氨酸的臨床應(yīng)用12-13
• 1.1.5 S-腺苷甲硫氨酸的穩(wěn)定性13-14
• 1.2 S-腺苷甲硫氨酸的生產(chǎn)方法14-15
• 1.2.1 化學(xué)合成法14
• 1.2.2 酶促轉(zhuǎn)化法14
• 1.2.3 微生物發(fā)酵法14-15
• 1.3 SAM合成酶15-17
• 1.3.1 大腸桿菌（Escherichia coli）SAM合成酶16
• 1.3.2 酵母SAM合成酶16
• 1.3.3 哺乳動(dòng)物SAM合成酶16-17
• 1.3.4 其它來源的SAM合成酶17
• 1.4 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）及其SAM合成途徑17-19
• 1.5 本論文主要研究?jī)?nèi)容19-21
• 1.5.1 立題依據(jù)和研究意義19
• 1.5.2 研究?jī)?nèi)容19-21
• 第二章 不同來源SAM合成酶在E. coli和C. glutamicum中表達(dá)和活性比較21-35
• 2.1 引言21
• 2.2 材料和方法21-29
• 2.2.1 菌株21-23
• 2.2.2 試劑和儀器23-24
• 2.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件24-25
• 2.2.4 分子生物學(xué)操作25-27
• 2.2.5 重組菌的蛋白表達(dá)分析27-28
• 2.2.6 酶活測(cè)定分析28
• 2.2.7 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定28
• 2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR28-29
• 2.3 結(jié)果和分析29-33
• 2.3.1 不同來源的SAM合成酶蛋白序列比對(duì)分析29-30
• 2.3.2 不同來源的SAM合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建30
• 2.3.3 不同來源的SAM合成酶在E. coli JM109中誘導(dǎo)表達(dá)30-31
• 2.3.4 三種不同野生型C. glutamicum合成SAM能力的比對(duì)31-32
• 2.3.5 S. cerevisiae和C. glutamicum來源的SAM合成酶在C. glutamicum中誘導(dǎo)表達(dá)32
• 2.3.6 RT-PCR和SDS-PAGE確定SAM2失活的原因32-33
• 2.4 討論33-34
• 2.5 本章小結(jié)34-35
• 第三章S. cerevisiae來源的SAM2基因的優(yōu)化以及酶學(xué)性質(zhì)研究35-46
• 3.1 引言35
• 3.2 材料和方法35-38
• 3.2.1 菌株、質(zhì)粒及相關(guān)引物35-36
• 3.2.2 試劑和儀器36
• 3.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件36
• 3.2.4 分子生物學(xué)操作36
• 3.2.5 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定36-37
• 3.2.6 重組菌的蛋白表達(dá)分析及分離純化37
• 3.2.7 純化后酶酶活的測(cè)定37-38
• 3.3 結(jié)果和分析38-44
• 3.3.1 S. cerevisiae來源的SAM合成酶密碼子優(yōu)化38-40
• 3.3.2 SAM2優(yōu)化基因SAM2C在C. glutamicum中誘導(dǎo)表達(dá)40-41
• 3.3.3 ATCC 13032/pDXW8metK和ATCC 13032/pDXW8SAM2C分批補(bǔ)料發(fā)酵41
• 3.3.4 優(yōu)化后S. cerevisiae來源的SAM合成酶和C. glutamicum來源的SAM合成酶表達(dá)載體構(gòu)建41-42
• 3.3.5 兩種蛋白的純化及蛋白的SDS-PAGE分析42-43
• 3.3.6 兩種蛋白的最適反應(yīng)pH和溫度分析43-44
• 3.3.7 兩種酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)分析44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 本章小結(jié)45-46
• 第四章 由野生型C. glutamicum ATCC 13032構(gòu)建從頭合成SAM的菌株46-61
• 4.1 引言46
• 4.2 材料和方法46-51
• 4.2.1 菌株、質(zhì)粒及相關(guān)引物46-48
• 4.2.2 試劑和儀器48
• 4.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件48
• 4.2.4 分子生物學(xué)操作48-50
• 4.2.5 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定50-51
• 4.3 結(jié)果和分析51-58
• 4.3.1 相關(guān)表達(dá)和敲除質(zhì)粒的構(gòu)建51-52
• 4.3.2 通過敲除metB和Ncgl2640基因可以顯著降低異亮氨酸的合成同時(shí)提高SAM的積累52-53
• 4.3.3 關(guān)鍵酶表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 4.3.4 在WHQ104中過量表達(dá)metK和vgb可以進(jìn)一步提高SAM的積累54
• 4.3.5 在WHQ104菌表達(dá)metYX和hommlyscm可以提高SAM合成54-55
• 4.3.6 在WHQ104串聯(lián)表達(dá)metK-vgb，metYX，homm-lysCm對(duì)SAM合成的影響55-56
• 4.3.7 在WHQ104/pJYW4metK-vgb中添加甲硫氨酸和腺嘌呤對(duì)SAM積累的影響56-57
• 4.3.8 WHQ104/pJYW4metK-vgb和WHQ104/pJYW4metK-vgb-metYX-hommlyscm的補(bǔ)料分批發(fā)酵57-58
• 4.4 討論58-60
• 4.5 本章小結(jié)60-61
• 第五章 構(gòu)建SAM和異亮氨酸聯(lián)產(chǎn)的C. glutamicum61-74
• 5.1 引言61
• 5.2 材料和方法61-64
• 5.2.1 菌株、質(zhì)粒及相關(guān)引物61-63
• 5.2.2 試劑和儀器63
• 5.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件63
• 5.2.4 分子生物學(xué)操作63-64
• 5.2.5 重組菌的蛋白表達(dá)分析64
• 5.2.6 重組菌的酶活分析64
• 5.2.7 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定64
• 5.3 結(jié)果和分析64-72
• 5.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建64-65
• 5.3.2 在IWJ001中過量表達(dá)metK可以顯著提高胞內(nèi)的SAM產(chǎn)量65-66
• 5.3.3 過量表達(dá)vgb基因有利于提高IWJ001胞內(nèi)SAM的水平66-67
• 5.3.4 輔因子基因過量表達(dá)對(duì)IWJ001胞內(nèi)SAM的水平的影響67
• 5.3.5 IWJ001/pDXW8metK-vgb相關(guān)蛋白表達(dá)及酶活情況67-68
• 5.3.6 添加甲硫氨酸和腺苷可以提高IWJ001/pDXW8metK-vgb內(nèi)SAM產(chǎn)量68-69
• 5.3.7 共表達(dá)SAM2C和vgb可以提高IWJ001胞內(nèi)SAM的水平69-70
• 5.3.8 共表達(dá)homm和lysCm可以提高異亮氨酸產(chǎn)量70
• 5.3.9 IWJ001/pDXW8metK-vgb的分批補(bǔ)料發(fā)酵70-72
• 5.4 討論72-73
• 5.5 本章小結(jié)73-74
• 主要結(jié)論與展望74-76
• 論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)76-77
• 致謝77-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 附錄：作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文86

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