線性泛素鏈?zhǔn)钦婧思?xì)胞內(nèi)一種特殊多聚泛素鏈,由LUBAC復(fù)合物發(fā)揮泛素連接酶活性,催化泛素蛋白通過肽鍵首尾連接而成。線性泛素鏈參與調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞生理過程,包括NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞自噬等。病原菌在長(zhǎng)期與宿主斗爭(zhēng)中,進(jìn)化出多種逃逸宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制。先前已有研究報(bào)道,多種病原菌能夠分泌具有去泛素化酶活性的效應(yīng)蛋白,但這些效應(yīng)蛋白都只能水解以異肽鍵連接的泛素鏈,因此,病原菌中是否存在具有特異性水解線性泛素鏈活性的效應(yīng)蛋白,成為了 一個(gè)長(zhǎng)期存在的科學(xué)疑問。為了解決這個(gè)問題,我們針對(duì)病原菌效應(yīng)蛋白建立了去泛素化酶的篩選體系。通過篩選我們發(fā)現(xiàn),嗜肺軍團(tuán)菌中的效應(yīng)蛋白R(shí)avD,能夠特異性水解線性泛素鏈。為了揭示RavD的酶活機(jī)制,我們通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,解析了 RavD同源蛋白R(shí)avD1c與線性連接的diUb復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)中我們發(fā)現(xiàn),RavD是一個(gè)木瓜蛋白酶樣的去泛素化酶,具有Cys-His-Ser催化三聯(lián)體基序,其三維結(jié)構(gòu)不同于其他去泛素化酶,是一個(gè)擁有全新結(jié)構(gòu)的去泛素化酶。RavD結(jié)合diUb的兩個(gè)結(jié)合面以及介導(dǎo)和diUb之間相互作用的關(guān)鍵性氨基酸殘基決定了 RavD去泛素化酶活性的特... 

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 真核細(xì)胞泛素化修飾
        1.1.1 泛素化修飾概述
        1.1.2 泛素化修飾過程
        1.1.3 多聚泛素鏈的功能
        1.1.4 去泛素化酶
        1.1.5 線性泛素鏈的研究現(xiàn)狀
    1.2 嗜肺軍團(tuán)菌
        1.2.1 嗜肺軍團(tuán)菌概況
        1.2.2 嗜肺軍團(tuán)菌的感染過程
        1.2.3 嗜肺軍團(tuán)菌表面毒力因子
        1.2.4 嗜肺軍團(tuán)菌的分泌系統(tǒng)
    1.3 病原菌干擾宿主泛素化修飾
        1.3.1 干擾細(xì)胞泛素系統(tǒng)組分
        1.3.2 分泌具有E3連接酶活性的效應(yīng)蛋白
            1.3.2.1 介導(dǎo)經(jīng)典泛素化修飾
            1.3.2.2 介導(dǎo)非經(jīng)典泛素化修飾
        1.3.3 分泌具有DUB活性的效應(yīng)蛋白
        1.3.4 其他影響
            1.3.4.1 利用泛素系統(tǒng)調(diào)控效應(yīng)蛋白活性
            1.3.4.2 利用泛素化修飾降解其他效應(yīng)蛋白
    1.4 本研究的研究意義
2 材料與方法
    2.1 材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 分子克隆
            2.2.1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因
            2.2.1.2 PCR產(chǎn)物回收
            2.2.1.3 目的基因定點(diǎn)突變
            2.2.1.4 酶切
            2.2.1.5 連接或重組
            2.2.1.6 轉(zhuǎn)化
            2.2.1.7 目的基因陽性單克隆鑒定
            2.2.1.8 質(zhì)粒抽提
        2.2.2 蛋白表達(dá)與純化
            2.2.2.1 大腸桿菌表達(dá)蛋白
            2.2.2.2 親和層析純化標(biāo)簽蛋白
            2.2.2.3 純化無標(biāo)簽蛋白
            2.2.2.4 離子交換柱純化
            2.2.2.5 分子篩純化
        2.2.3 免疫印跡
        2.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.5 真核細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)
        2.2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)菌
        2.2.8 構(gòu)建基因敲除和基因回補(bǔ)的嗜肺軍團(tuán)菌菌株
        2.2.9 制備與轉(zhuǎn)化嗜肺軍團(tuán)菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)
        2.2.10 合成泛素鏈
        2.2.11 病原菌篩選實(shí)驗(yàn)
        2.2.12 篩選嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白
        2.2.13 RavD重組蛋白去泛素化酶活性驗(yàn)證
        2.2.14 酶解反應(yīng)后產(chǎn)生的單泛素蛋白再合鏈實(shí)驗(yàn)
        2.2.15 RavD重組蛋白水解M1-diUb實(shí)驗(yàn)
        2.2.16 RavD與GST-Ub,Flag-Ub和Ub-Flag的酶切實(shí)驗(yàn)
        2.2.17 GST-diUb pull-down實(shí)驗(yàn)
        2.2.18 GST-NEMO UBAN pull-down實(shí)驗(yàn)
        2.2.19 RavD抑制細(xì)胞內(nèi)IκBα降解實(shí)驗(yàn)
        2.2.20 核內(nèi)p65轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)
        2.2.21 磷脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.2.22 構(gòu)建OTULIN敲除的U937細(xì)胞系
        2.2.23 檢測(cè)LCV周圍的線性鏈
        2.2.24 檢測(cè)感染過程中RavD對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響
        2.2.25 檢測(cè)RavD對(duì)細(xì)胞內(nèi)嗜肺軍團(tuán)菌增殖的影響
        2.2.26 RavD定位實(shí)驗(yàn)
        2.2.27 蛋白結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 嗜肺軍團(tuán)菌具有水解線性泛素鏈活性
    3.2 嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白R(shí)avD發(fā)揮水解線性泛素鏈的活性
    3.3 RavD是一個(gè)特異性水解線性泛素鏈的DUB
        3.3.1 RavD對(duì)底物具有特異性
        3.3.2 RavD是一個(gè)去泛素化酶
    3.4 RavD和M1-diUb直接相互作用
    3.5 RavD與M1-diUb復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)
        3.5.1 RavD的三維結(jié)構(gòu)
        3.5.2 RavD具有Cys-His-Ser催化三聯(lián)體基序
        3.5.3 RavD特異性的決定因素
    3.6 RavD抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路
    3.7 RavD在嗜肺軍團(tuán)菌感染過程中的影響
        3.7.1 RavD分泌后定位在LCV膜上
        3.7.2 RavD抑制線性泛素鏈在LCV上積累
        3.7.3 RavD抑制感染過程中NF-κB信號(hào)通路激活
        3.7.4 RavD對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌在細(xì)胞內(nèi)增殖幾乎沒有影響
    3.8 RavD廣泛存在于軍團(tuán)菌不同菌種中
4 討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 討論與展望
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3666639