線粒體是細胞中的能量工廠,也是細胞中多種代謝過程的中心。因此人類健康與線粒體的穩(wěn)態(tài)及其正常功能的維持密不可分。本論文的研究圍繞線粒體,構建了線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點的報告子,還研究了線粒體內(nèi)一個參與脯氨酸和鳥氨酸前體吡咯啉-5-羧酸（P5C）合成的酶P5CS調(diào)控線粒體內(nèi)多種代謝途徑的分子機制。線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點（MERCs）是線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間進行鈣離子及磷脂交換的位置,也是細胞多種信號通路交互的平臺。但目前對MERCs的組成、分布和動態(tài)變化了解還十分有限。研究最大的困難是缺乏簡單實用的指示MERCs的標記物。本論文第一部分的研究構建了一個全新的能指示MERCs的工具,并利用這個工具分析了在不同刺激下細胞內(nèi)MERCs的動態(tài)變化。這一工具基于Split GFP的Split GFP1-10和Split GFP11距離接近時會相互作用折疊成可以發(fā)出綠色熒光的GFP的機理。我們將編碼Split GFP1-10和Split GFP11的DNA序列分別與編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體定位信號的DNA序列連接起來,并在Split GFP11與線粒體定位序列間加入不同長度的連接子,構建表達質(zhì)粒。進而在細胞中同時... 

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
1 緒論
    1.1 線粒體與人類健康
    1.2 線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸
    1.3 脂代謝與疾病
    1.4 總結
2 線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點新型標記工具的構建及其特性研究
    2.1 前言
    2.2 實驗材料與方法
        2.2.1 表達質(zhì)粒構建
        2.2.2 哺乳動物細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.3 報告子穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構建
        2.2.4 篩選報告子穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
        2.2.5 細胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 熒光實時定量PCR
        2.2.7 免疫熒光制片
        2.2.8 細胞熒光成像的觀察與處理
        2.2.9 細胞電鏡
        2.2.10 細胞周期同步化處理
        2.2.11 藥物處理
        2.2.12 Western blot(WB)
        2.2.13 統(tǒng)計分析
        2.2.14 抗體信息
    2.3 實驗結果
        2.3.1 構建能監(jiān)測線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點的報告子
        2.3.2 報告子正確性的驗證
        2.3.3 報告子靈敏度的檢驗
        2.3.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體接觸位點的動態(tài)性
        2.3.5 有絲分裂進程中接觸位點的觀察
        2.3.6 MERCs與線粒體狀態(tài)高度相關
        2.3.7 MERCs豐度受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響不大
        2.3.8 不同胞內(nèi)應激條件對MERCs的影響
    2.4 總結與討論
3 吡咯啉-5-羧酸合成酶可感知細胞應激并通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸來調(diào)節(jié)其他代謝途徑
    3.1 前言
    3.2 實驗材料與方法
        3.2.1 表達質(zhì)粒的構建和siRNA序列信息
        3.2.2 哺乳動物細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        3.2.3 Cas9 方法制備P5CS敲除細胞系
        3.2.4 果蠅的管理及品系獲得
        3.2.5 熒光實時定量PCR
        3.2.6 細胞免疫熒光制片與觀察
        3.2.7 細胞內(nèi)脂消耗速率與合成速率的測量
        3.2.8 電鏡樣品的制備與觀察
        3.2.9 細胞增殖和存活實驗
        3.2.10 線粒體蛋白酶K(PK)消化實驗
        3.2.11 堿碳酸鹽萃取試驗
        3.2.12 免疫共沉淀實驗(Co-IP)
        3.2.13 細胞線粒體壓力測試
        3.2.14 線粒體底物分析
        3.2.15 BN-PAGE分析線粒體復合物
        3.2.16 代謝組學試驗
        3.2.17 圖像處理及統(tǒng)計分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 P5CS在線粒體內(nèi)呈棒狀或環(huán)狀分布
        3.3.2 P5CS點狀分布需要其多聚化位點
        3.3.3 P5CS在氧化應激下定位趨向擴散
        3.3.4 P5CS缺失會導致細胞對脅迫敏感性增加及果蠅的神經(jīng)退行
        3.3.5 P5CS缺失導致多種代謝缺陷
        3.3.6 P5CS的缺失抑制β-氧化代謝
        3.3.7 P5CS對線粒體正常氧化呼吸的進行至關重要
    3.4 總結討論
參考文獻
線粒體疾病
    綜述參考文獻
作者簡歷



本文編號：3663490