大部分遺傳改變都存在一定的回復(fù)概率,一方面這些改變可能對(duì)某些不利的生長(zhǎng)環(huán)境具有一定的抵抗作用,如:藥物處理?xiàng)l件,但當(dāng)不利條件解除后,這些改變的存在可能對(duì)生物體的正常生長(zhǎng)起抑制作用。因此,如何對(duì)多變的外界環(huán)境做出快速的遺傳改變從而適應(yīng)環(huán)境,對(duì)生物體而言是一項(xiàng)重要的挑戰(zhàn)。我的研究在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)了一種可逆的介導(dǎo)抗藥性的遺傳突變---微型同源臂介導(dǎo)的串聯(lián)重復(fù)（簡(jiǎn)稱為MTD）,其在一定的條件下能夠回復(fù)至野生型序列。因此,我對(duì)裂殖酵母基因組上一定條件范圍內(nèi)所有的微型同源臂序列（MHPs）進(jìn)行了注釋,發(fā)現(xiàn)MHP序列在基因組上普遍存在（～2.5×10⁷個(gè)）,提供大量的潛在MTD突變位點(diǎn)。MTD的頻率受到發(fā)生概率、回復(fù)概率、及適應(yīng)性等方面共同作用。通過對(duì)10,000x全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行MTD突變檢測(cè),我在單細(xì)胞起源的細(xì)胞群體中發(fā)現(xiàn)了近6000個(gè)亞克隆MTDs突變位點(diǎn);通過使用特殊的預(yù)測(cè)模型及高溫篩選策略,我初步了解了MTD的發(fā)生與回復(fù)是如何受調(diào)控的。根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果,基因內(nèi)發(fā)生MTD概率最高的MHP位點(diǎn)往往插入MTDs后不會(huì)改變基因的閱讀框,而基因組上大量MHPs的存在及可逆的... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1.引言
    1.1 基因組不穩(wěn)定性
        1.1.1 介導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性的突變類型
        1.1.2 調(diào)控基因組不穩(wěn)定性的相關(guān)機(jī)制
        1.1.3 基因組不穩(wěn)定性發(fā)生的“熱點(diǎn)”
    1.2 串聯(lián)重復(fù)序列
        1.2.1 串聯(lián)重復(fù)序列
        1.2.2 調(diào)控串聯(lián)重復(fù)序列不穩(wěn)定性的機(jī)制
        1.2.3 串聯(lián)重復(fù)序列的來源
    1.3 兩端帶有短同源序列的片段重復(fù)---具有微型同源臂的片段串聯(lián)重復(fù)
        1.3.1 微型同源臂介導(dǎo)的片段串聯(lián)重復(fù)
        1.3.2 微型同源臂介導(dǎo)的片段串聯(lián)重復(fù)可能的調(diào)控機(jī)制
    1.4 表觀基因組(Epigenome)不穩(wěn)定性
    1.5 雷帕霉素抗藥性與TOR通路
        1.5.1 雷帕霉素
        1.5.2 TOR通路上游調(diào)控因子
        1.5.3 TOR通路下游效應(yīng)因子
2.材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 模式生物---栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces.pombe)
        2.1.2 菌株列表
        2.1.3 主要引物列表
        2.1.4 主要藥物與試劑
        2.1.5 相關(guān)溶液配制
        2.1.6 常用培養(yǎng)基所需材料與配方
        2.1.7 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 常規(guī)PCR與重疊PCR
        2.2.2 分子克隆
        2.2.3 提取裂殖酵母基因組
        2.2.4 酵母轉(zhuǎn)化
        2.2.5 菌株凍存與活化
        2.2.6 篩選具有遺傳不穩(wěn)定性的突變菌株
        2.2.7 遺傳連鎖性分析(genetic linkage test)
        2.2.8 全基因組測(cè)序(whole genome sequencing)
        2.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)
        2.2.10 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)
        2.2.11 雙突變文庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.12 高溫(36℃)條件下檢測(cè)MTD突變發(fā)生回復(fù)的概率
        2.2.13 yox1-GFP表達(dá)的遺傳穩(wěn)定性探究
        2.2.14 二倍體菌株構(gòu)建
        2.2.15 高深度全基因組測(cè)序
        2.2.16 超高深度定點(diǎn)二代測(cè)序
3.結(jié)果
    3.1 裂殖酵母中具有微型同源臂特征的短片段串聯(lián)重復(fù)介導(dǎo)的具有遺傳不穩(wěn)定性的表型
        3.1.1 ssp1 基因發(fā)生可逆的短片段串聯(lián)重復(fù)(MTD)突變介導(dǎo)不穩(wěn)定遺傳的雷帕霉素(+咖啡因)抗藥性
        3.1.2 Cnp1~(H100M)生長(zhǎng)缺陷菌株進(jìn)行生長(zhǎng)抑制子(Suppressor)篩選中發(fā)現(xiàn)同種類型的MTD突變
    3.2 超深度定點(diǎn)測(cè)序及10,000X全基因組測(cè)序驗(yàn)證細(xì)胞群體中亞克隆MTDS的存在及可能的調(diào)控元件
        3.2.1 超深度測(cè)序方法的運(yùn)用及其檢測(cè)MTD的有效性
        3.2.2 運(yùn)用超深度測(cè)序檢測(cè)單細(xì)胞起源的細(xì)胞群體中的亞克隆MTDs突變
        3.2.3 運(yùn)用超深度測(cè)序及邏輯回歸模型驗(yàn)證影響MTDs發(fā)生的順式-決定元件(cis-determinants)
    3.3 復(fù)制打滑(REPLICATION SLIPPAGE)模型對(duì)SSP1 位點(diǎn)短片段串聯(lián)重復(fù)(MTD)的回復(fù)起重要的調(diào)控作用
    3.4 自然分離菌株中,近一半的串聯(lián)重復(fù)和插入突變具有微型同源臂特征
4.結(jié)論與討論
    4.1 MTDS介導(dǎo)不穩(wěn)定遺傳的抗藥性及生長(zhǎng)回復(fù)
    4.2 超深度測(cè)序檢測(cè)亞克隆MTDS
    4.3 介導(dǎo)MTDS的復(fù)制打滑模型(Replication Slippage)
5.參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3645751