本文關鍵詞：c-Myc蛋白去泛素化機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一個受到精密調(diào)控的級聯(lián)酶促反應。蛋白質(zhì)的泛素化可介導蛋白質(zhì)降解,細胞增殖生長與分化,細胞免疫應答,細胞凋亡,細胞內(nèi)膜蛋白的分選和運送等過程。蛋白質(zhì)的泛素化修飾也是由去泛素化酶介導的一類可逆反應。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的去泛素化過程失調(diào)可導致諸如腫瘤等疾病的發(fā)生。USP37屬于去泛素化酶家族的半胱氨酸水解酶家族,能夠通過調(diào)控CyclinA蛋白穩(wěn)定性調(diào)控細胞周期進程由G1期進入S期；USP37還能夠調(diào)控PLZF/RARA蛋白穩(wěn)定性進而參與到急性早幼粒細胞白血病的發(fā)生中。已有的報道也表明USP37的表達受到REST的調(diào)控,進而調(diào)控細胞周期調(diào)控蛋白p27的蛋白穩(wěn)定性參與神經(jīng)細胞增殖；可見USP37在不同組織細胞中通過調(diào)控不同的底物發(fā)揮作用,已有的研究表明,USP37在非小細胞肺癌中是高表達的,但是在肺組織中USP37的底物及其與肺癌發(fā)生的關系目前還不清楚。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc在多種組織和種屬中廣泛表達,通過調(diào)控基因組15%基因的轉(zhuǎn)錄而參與到細胞周期調(diào)控,細胞代謝,細胞分化與衰老,蛋白質(zhì)合成,線粒體功能等生命活動過程中。細胞內(nèi)c-Myc功能失調(diào)會引起高達20%癌癥的發(fā)生。c-Myc發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用主要是通過其N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域,協(xié)同bHLH結(jié)合蛋白MAX結(jié)合在包含特定DNA序列的基因啟動子區(qū)而啟動轉(zhuǎn)錄激活。細胞內(nèi)c-Myc的蛋白表達水平調(diào)控除了受到MAX形成異源二聚體調(diào)控外,轉(zhuǎn)錄,mRNA穩(wěn)定性,以及諸如磷酸化,乙酰化,泛素化等翻譯后修飾也會參與調(diào)控c-Myc的表達。目前發(fā)現(xiàn)了調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的多個 E3 泛素連接酶,包括Fbw7,SKP2,HectH9等,這些 E3 通過對c-Myc的K48位的多泛素化將其靶定到蛋白酶體降解。c-MycT58及S62位的磷酸化對其同F(xiàn)bw7的結(jié)合并被其泛素化降解至關重要。相應地,c-Myc的去泛素化酶卻只發(fā)現(xiàn)了USP28,并且USP28對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控是Fbw7依賴的,不能同F(xiàn)bw7結(jié)合的c-Myc的突變體則不能被USP28穩(wěn)定。但是,Fbw7在許多腫瘤中都是缺失或者突變的,那么這種情況下c-Myc的蛋白穩(wěn)定性是如何被調(diào)控的,是否存在新的直接的去泛素化酶調(diào)控c-Myc的蛋白穩(wěn)定性都還不清楚。此外,USP28對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控在肺癌細胞系中不成立的,那么在肺癌的發(fā)生過程中,是否存在去泛素化酶通過調(diào)控c-Myc蛋白穩(wěn)定性參與肺癌的發(fā)生也不清楚。在本論文中,我們通過分子生物學,細胞生物學的實驗方法,發(fā)現(xiàn)了能夠直接調(diào)控c-Myc蛋白穩(wěn)定性的新的去泛素化酶USP37。USP37以不依賴于Fbw7的方式同c-Myc直接結(jié)合,去泛素化c-Myc,進而通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游基因的轉(zhuǎn)錄激活參與到c-Myc介導的肺癌細胞增殖和瓦博格效應等生物學過程中。另一方面,我們利用生物信息學及免疫組織化學染色的實驗方法,對大量的肺癌病人組織樣本分析得出,USP37由于可能受到較低甲基化調(diào)控使其在肺癌中特異性高表達,且其表達同c-Myc的表達有很好的正相關性。我們的研究為肺癌的臨床治療和相關藥物開發(fā)提供很好的藥物靶標和可靠的理論基礎。本論文主要包括以下幾部分：一.c-Myc新的去泛素化酶USP37的鑒定我們在肺癌細胞系H1299中過表達若干去泛素化酶,篩選到去泛素化酶USP37顯著穩(wěn)定內(nèi)源c-Myc, USP37對c-Myc的調(diào)控是劑量依賴的,并且依賴于USP37的去泛素化酶活性。接著我們利用實驗室的LPDS雙系統(tǒng)驗證同熒光素酶融合的c-Myc也能被USP37穩(wěn)定,而活性缺失的USP37C350S卻不具有這種作用。在H1299細胞中,過表達USP37后,內(nèi)源c-Myc的半衰期明顯延長,表明USP37對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平。上述實驗結(jié)果表明,去泛素化酶USP37在過表達的條件下穩(wěn)定c-Myc的蛋白穩(wěn)定性,而且這種作用依賴于USP37的去泛素化酶活性。二.USP37在肺癌細胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的分子機制研究1.USP37對c-Myc蛋白穩(wěn)定性的機制研究USP37被干擾低表達時肺癌細胞中內(nèi)源c-Myc的蛋白水平也隨之明顯減少,而c-Myc的RNA水平并沒有明顯的變化,這表明USP37對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控發(fā)生在翻譯后水平。接下來的pulse-chase實驗發(fā)現(xiàn)USP37被干擾低表達后,內(nèi)源c-Myc的半衰期明顯縮短。進一步利用refeed的模型,將處于低血清濃度的細胞重新加入新鮮培養(yǎng)基,觀察一段時間內(nèi)內(nèi)源c-Myc蛋白水平的變化,結(jié)果表明,在refeed的過程中,c-Myc的蛋白穩(wěn)定性持續(xù)受到USP37的調(diào)控。2.USP37與c-Myc的相互作用通過免疫共沉淀試驗,我們發(fā)現(xiàn)USP37在體內(nèi)外同c-Myc直接結(jié)合。免疫熒光的實驗得出USP37和c-Myc共定位在細胞核中。Pull Down實驗證明USP37在體外可以同c-Myc直接結(jié)合。我們還構建了c-Myc的分段克隆,利用免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)c-Myc的包含MBⅢ的中心段同USP37結(jié)合,并且缺失這一段的突變體不能被USP37穩(wěn)定。3.USP37去泛素化c-Myc通過Ni-NTA的方法表明,USP37可顯著去泛素化c-Myc,而USP37C350S則不能。進一步在H1299細胞中干擾內(nèi)源USP37,檢測內(nèi)源c-Myc的泛素化水平,發(fā)現(xiàn)USP37低表達時,c-Myc的泛素化水平明顯上調(diào)。c-Myc的泛素化水平能夠明顯被USP37純蛋白減弱。上述結(jié)果表明,c-Myc在肺癌細胞中的蛋白水平受蛋白酶體的調(diào)控；體內(nèi)和體外實驗證明,USP37能夠直接同c-Myc結(jié)合并去泛素化c-Myc進而對其穩(wěn)定性進行調(diào)控。三.USP37在肺癌細胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的相關生物學功能研究1.USP37促進c-Myc介導的肺癌細胞的增殖通過MTT實驗及克隆形成實驗得出H1299細胞中干擾siRNA使USP37低表達時,能顯著抑制肺癌細胞的增殖。但是當同時干擾掉c-Myc的表達,再利用MTT及克隆形成的增值實驗,發(fā)現(xiàn)USP37仍然能夠抑制肺癌細胞的增殖,但是同時敲除c-Myc時,肺癌細胞的增殖情況并無明顯變化。這些結(jié)果證明了USP37通過影響c-Myc而影響肺癌細胞的增殖。2.USP37促進c-Myc介導的瓦伯格效應在H1299中分別干擾USP37,c-Myc及同時干擾USP37和c-Myc,檢測葡萄糖攝取量及乳酸生成量。當USP37下調(diào)時,葡萄糖攝取量及乳酸生成量明顯下降。而同時干擾USP37及c-Myc時,這兩項指標并無明顯變化。證明USP37對反應瓦伯格效應的兩項指標葡萄糖攝取量及乳酸生成量的影響是通過調(diào)控c-Myc的蛋白表達量實現(xiàn)的。同時我們檢測了位于c-Myc下游的受轉(zhuǎn)錄因子c-Myc調(diào)控的兩個瓦伯格效應相關基因LDHA及Glut1的表達,結(jié)果表明,干擾USP37可使位于c-Myc下游的瓦伯格效應相關蛋白Glut1及LDHA下調(diào)。上述結(jié)果表明,USP37能以去泛素化酶活性依賴的方式促進c-Myc介導的肺癌細胞的增殖。USP37通過穩(wěn)定c-Myc的蛋白表達,上調(diào)位于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游的瓦伯格效應相關基因LDHA及Glut1而調(diào)控瓦博格效應。四.USP37在肺癌病人組織樣品中同c-Myc表達相關性的研究通過免疫組織化學實驗,分析了肺癌病人的肺癌組織及癌旁組織中USP37的表達情況。結(jié)果表明,在高達69%的包括肺鱗癌和肺腺癌的肺癌病人樣本中USP37在肺癌組織中特異性高表達。接著我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫里在肺癌病人組織樣品中,USP37同轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游的調(diào)控基因CNNB1的表達有很好的正相關性。接著分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中多例肺癌組織中USP37基因甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),USP37在肺癌組織中的高表達是由于其基因較低的甲基化水平造成的。進一步我們利用免疫組織化學的方法分析了肺癌組織中USP37表達同c-Myc表達的相關性,實驗結(jié)果表明,USP37的表達同c-Myc的表達在肺癌病人組織樣品中有很好的正相關性。上述結(jié)果表明,去泛素化酶USP37在肺鱗癌及肺腺癌病人樣品中特異性高表達,且USP37的基因表達收到甲基化調(diào)控,在肺癌病人組織樣品中,USP37的高表達是由于其較低的甲基化水平造成的。免疫組織化學實驗結(jié)果表明,USP37的蛋白表達同c-Myc的蛋白表達具有很好的正相關。
【關鍵詞】：去泛素化 USP37 c-Myc Fbw7 肺癌發(fā)生
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-16
• 目錄16-18
• 第一章 研究背景及文獻綜述18-33
• 一、蛋白質(zhì)的泛素化與去泛素化18-33
• (一)、蛋白質(zhì)的泛素化修飾18-20
• (二)、蛋白質(zhì)的去泛素化修飾20-28
• (三)、癌蛋白c-Myc28-33
• 第二章 c-Myc新的去泛素化酶USP37的鑒定33-51
• 一、實驗材料、試劑與儀器33-40
• 二、實驗方法40-44
• 三、結(jié)果與分析44-49
• 四、小結(jié)與討論49-51
• 第三章 USP37在肺癌細胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的分子機制研究51-80
• 一、實驗材料、試劑與儀器51-56
• 二、實驗方法56-70
• 三、結(jié)果與分析70-79
• 四、小結(jié)與討論79-80
• 第四章 USP37在肺癌細胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的相關生物學功能研究80-88
• 一、實驗材料、試劑與儀器80-81
• 二、實驗方法81-83
• 三、結(jié)果與分析83-87
• 四、小結(jié)和討論87-88
• 第五章 USP37在肺癌病人樣品中同c-Myc表達相關性研88-103
• 一、實驗材料、試劑與儀器88-90
• 二、實驗方法90-97
• 三、結(jié)果與分析97-101
• 四、小結(jié)和討論101-103
• 第六章 論文總結(jié)及討論103-107
• 附錄Ⅰ 縮略詞107-109
• 附錄Ⅱ 科研成果109-110
• 參考文獻110-118
• 致謝118-

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