A型流感病毒可以感染禽類和哺乳動物等多種宿主,亞型多且感染譜廣,其跨種間傳播往往造成嚴(yán)重危害甚至大流行,因此其復(fù)制及跨種傳播機制一直是本領(lǐng)域研究熱點。流感病毒的RNA聚合酶是病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的物質(zhì)基礎(chǔ),在跨物種傳播中發(fā)揮重要作用,其需借助某些宿主蛋白來完成病毒的復(fù)制過程。目前關(guān)于流感病毒聚合酶對宿主的依賴機制及跨物種適應(yīng)機制仍知之甚少。已有研究發(fā)現(xiàn)禽源酸性核磷蛋白32（ANP32）家族蛋白成員ANP32A與禽流感病毒聚合酶的種屬特異性相關(guān),但ANP32A及其家族其他蛋白與流感病毒聚合酶相互作用及功能并不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了一系列聚合酶相關(guān)宿主蛋白的HEK293T敲除細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染H1N1亞型流感A/Sichuan/01/2009（H1N1SC09）聚合酶報告系統(tǒng),檢測發(fā)現(xiàn)人ANP32A（huANP32A）或ANP32B（huANP32B）單獨敲除時均不影響聚合酶活性。由于ANP32A與ANP32B為結(jié)構(gòu)類似的同一家族蛋白,因此推測二者可能功能類似,單獨敲除一個蛋白,另一個蛋白仍會發(fā)揮作用,因此該團隊構(gòu)建了 ANP32A&B雙敲除的細(xì)胞系（... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 A型流感病毒
        1.1.1 A型流感病毒復(fù)制周期
        1.1.2 A型流感病毒跨物種傳播
    1.2 vRNP
        1.2.1 病毒基因組轉(zhuǎn)錄即vRNA→mRNA
        1.2.2 病毒基因組復(fù)制即vRNA→cRNA→vRNA
    1.3 ANP32蛋白研究進展
        1.3.1 ANP32蛋白概述
        1.3.2 ANP32蛋白與病毒復(fù)制研究進展
    1.4 本研究的目的與意義
第2章 ANP32家族蛋白在A型流感病毒復(fù)制及其跨物種傳播中的作用機制
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
    2.2 研究方法
        2.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 敲除細(xì)胞系構(gòu)建
        2.2.3 雙熒光報告系統(tǒng)檢測流感病毒聚合酶活性
        2.2.4 qRT-PCR檢測流感病毒RNA的合成
        2.2.5 A型流感病毒拯救及病毒感染實驗
        2.2.6 免疫共沉淀實驗
        2.2.7 雙抗夾心ELISA檢測病毒包裝
    2.3 研究結(jié)果
        2.3.1 人源ANP32A&B是支持人源A型流感病毒聚合酶活性的決定性宿主因子
        2.3.2 ANP32A&B調(diào)控流感病毒的RNA合成、vRNP組裝及病毒包裝
        2.3.3 不同物種ANP32蛋白對不同物種流感病毒的支持作用
        2.3.4 ANP32蛋白對流感病毒發(fā)揮支持作用的關(guān)鍵氨基酸位點的確定
        2.3.5 哺乳動物ANP32A蛋白跨種支持禽源聚合酶的研究
    2.4 討論
第3章 全文結(jié)論
致謝
參考文獻
作者簡介



本文編號：3461785