發(fā)布時間：2021-05-18 10:05

　　異化金屬還原菌（Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB）是一類能利用胞外金屬氧化物進行呼吸并儲存能量用于生長、代謝的微生物,其底物代謝產(chǎn)生的電子通常需要經(jīng)過復(fù)雜的電子傳遞網(wǎng)絡(luò)才能傳遞給胞外電子受體。除金屬氧化物外,DMRB還可以將電子傳遞給金屬離子、電極以及多種污染物。因此,它們在重金屬（包括放射性核素）去除、生態(tài)修復(fù)和能源回收中具有巨大的應(yīng)用價值。但是,較低的胞外電子傳遞（Extracellular Electron Transfer,EET）效率是目前制約DMRB在生態(tài)修復(fù)和能源生產(chǎn)等領(lǐng)域應(yīng)用的主要瓶頸之一。本論文以Shewanella oneidensis MR-1為底盤微生物,以強化其胞外電子傳遞能力為目標,研發(fā)了一體化CRISPR平臺、基因網(wǎng)絡(luò)集成策略、新型基因組編輯工具、無抗生素基因載體等多種基因工程技術(shù)。基于這些技術(shù),繼而探究了基因組EET途徑的重構(gòu)和優(yōu)化對污染物生物降解的強化作用,以及復(fù)雜EET基因網(wǎng)絡(luò)對電子傳遞的提升作用,并為S.oneidensis進行生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)。本文的研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下:1.S.onei... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：160 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 異化金屬還原模式菌-DMRB
        1.2.1 Shewanella屬
        1.2.2 Shewanella oneidensis MR-1
    1.3 DMRB的生物學(xué)研究
        1.3.1 DMRB的環(huán)境分布和功能
        1.3.2 DMRB的分子生物學(xué)研究
    1.4 DMRB的胞外電子傳遞
        1.4.1 NADH池和甲基萘醌類池
        1.4.2 依賴于細胞色素c的直接電子傳遞
        1.4.3 依賴于納米導(dǎo)線的電子傳遞
        1.4.4 依賴于電子穿梭體的間接電子傳遞
    1.5 基因編輯技術(shù)
        1.5.1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.5.2 基因編輯技術(shù)的類型
        1.5.3 基因編輯技術(shù)在環(huán)境功能微生物中的應(yīng)用
    1.6 本文研究的主要內(nèi)容,目的和意義
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 研究目的和意義
    參考文獻
第二章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞鏈的CRISPR-Cas9基因編輯
    2.1 概述
    2.2 材料和方法
        2.2.1 巢湖底泥基因豐度和群落結(jié)構(gòu)測定
        2.2.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        2.2.3 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.2.4 基因操作、質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)移
        2.2.5 GFP-lacZ報告菌株的構(gòu)建
        2.2.6 “易編輯型”CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建和基因編輯操作流程
        2.2.7 細胞色素c、黃素和NADH的測定方法
        2.2.8 表達基因的定量PCR
        2.2.9 電化學(xué)實驗方法
        2.2.10 U(Ⅵ)還原實驗及產(chǎn)物表征方法
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 功能微生物在巢湖底泥中的分布特征
        2.3.2 借助CRISPR-Cas9開發(fā)增強EET能力的CRISPR-GPS
        2.3.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在S.oneidensis中的效率評估
        2.3.4 基于CRISPR-GPS的胞外電子傳遞網(wǎng)絡(luò)的基因編輯
        2.3.5 編輯菌株的生物學(xué)特性和電化學(xué)特征
        2.3.6 編輯菌株增強U(Ⅵ)還原
    2.4 小結(jié)
    參考文獻
第三章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞基因網(wǎng)絡(luò)平臺的構(gòu)建和應(yīng)用
    3.1 概述
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        3.2.2 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備及質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移
        3.2.3 基于Int因子的基因網(wǎng)絡(luò)平臺的構(gòu)建
        3.2.4 依賴于CRISPR-Cas9_((3.7))系統(tǒng)的基因編輯
        3.2.5 細胞色素c和黃素的測定方法
        3.2.6 表達基因的定量PCR
        3.2.7 電化學(xué)實驗方法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 DMRB基因網(wǎng)絡(luò)平臺的構(gòu)建
        3.3.2 基因網(wǎng)絡(luò)平臺整合-環(huán)化效率的評估
        3.3.3 細胞色素c途徑的啟動子重構(gòu)和黃素合成途徑的快速整合
        3.3.4 工程菌株的生物學(xué)特性
        3.3.5 工程菌株的產(chǎn)電能力強化
    3.4 小結(jié)
    參考文獻
第四章 S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞鏈I-SceI-RecET的基因編輯
    4.1 概述
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        4.2.2 coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備及質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移
        4.2.3 基因操作及藍白斑篩選實驗
        4.2.4 細胞色素c和吩嗪的測定方法
        4.2.5 異源基因表達的定量PCR
        4.2.6 電化學(xué)測試方法
        4.2.7 污染物還原實驗
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 iEditing基因編輯工具的設(shè)計和構(gòu)建
        4.3.2 編輯工具在S.oneidensis中的驗證
        4.3.3 偶聯(lián)重組系統(tǒng)提高基因組編輯效率
        4.3.4 在S.oneidensis中重構(gòu)額外的EET途徑
        4.3.5 編輯菌株的生物學(xué)和電化學(xué)特性
        4.3.6 編輯菌株強化污染物還原
        4.3.7 編輯工具在其他革蘭氏陰性菌中的應(yīng)用
    4.4 小結(jié)
    參考文獻
第五章 S.oneidensis MR-1中不依賴于抗生素遺傳操作平臺的設(shè)計和建立
    5.1 概述
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件
        5.2.2 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備及質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)移
        5.2.3 基因操作及質(zhì)粒穩(wěn)定性的測定
        5.2.4 細胞色素c和甲基萘醌的測定
        5.2.5 基因表達的定量PCR
        5.2.6 電化學(xué)測試方法
        5.2.7 污染物的還原實驗
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 基于I-SceI的S.oneidensis MR-1大質(zhì)粒消除
        5.3.2 基于內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始因子的質(zhì)粒平臺構(gòu)建
        5.3.3 不依賴于抗生素工程菌株的構(gòu)建
        5.3.4 細胞色素c和甲基萘醌過表達菌株的構(gòu)建與表征
        5.3.5 強化染料和重金屬還原
    5.4 小結(jié)
    參考文獻
結(jié)論
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3193601