豆科植物與根瘤菌之間共生固氮關系的建立,需要寄、宿主雙方對對方信號的接受和反饋。豆科植物釋放類黃酮,根瘤菌接受類黃酮信號之后誘導結瘤相關基因表達,并分泌結瘤因子;豆科植物在感知結瘤因子信號之后,開啟信號轉導網絡,啟動共生結瘤相關基因的表達,最終形成共生體—根瘤。百脈根中感知結瘤因子信號的是兩個Lys M類受體激酶NFR1/NFR5,并向下游效應基因傳遞結瘤因子信號。盡管我們知道其下游的效應基因是SYMRK,但是如何傳遞的機制不清楚。研究表明ROP6與NFR5相互作用,并通過調節(jié)侵入線的發(fā)育正調控結瘤。本研用ROP6為誘餌蛋白,從百脈根AD-c DNA文庫篩選與其相互作用蛋白來展開,主要結果如下:1.以ROP6為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交技術從百脈根AD-c DNA文庫中篩選分離到網格重鏈蛋白CHC2,體外pull-down實驗和煙草葉片雙分子熒光互補實驗進一步證實了ROP6與CHC2的相互作用。用生物信息學的方法分析CHC2的結構,并根據(jù)結構將CHC2截成9個不同大小區(qū)段,鑒定出與ROP6相互作用的結構域。2.克隆百脈根另一個CHC基因—CHC6以及幾個百脈根小G蛋白,利用酵母雙雜交實驗... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 共生固氮的概念及意義
    1.2 豆科植物與根瘤菌根瘤共生固氮體系
        1.2.1 根瘤菌與豆科植物
        1.2.2 根瘤的形成
    1.3 根瘤菌中參與的結瘤基因
    1.4 結瘤因子
    1.5 結瘤因子信號轉導途徑
        1.5.1 結瘤因子受體激酶
        1.5.2 結瘤因子信號轉導途徑
    1.6 小G蛋白
        1.6.1 小G蛋白的結構及調節(jié)機制
        1.6.2 小G蛋白的分類
        1.6.3 小G蛋白生物學功能
    1.7 網格蛋白
        1.7.1 網格重鏈蛋白
        1.7.2 網格輕鏈蛋白
        1.7.3 網格蛋白介導的胞吞作用機制
        1.7.4 網格蛋白的功能
        1.7.5 磷酸化調節(jié)網格蛋白介導的受體內吞
    1.8 本實驗的研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 質粒
        2.1.4 主要分子生物學試劑
        2.1.5 常用培養(yǎng)基配方
            2.1.5.1 大腸桿菌培養(yǎng)基
            2.1.5.2 酵母培養(yǎng)基
            2.1.5.3 根瘤菌培養(yǎng)基
            2.1.5.4 植物生長培養(yǎng)基
            2.1.5.5 毛根轉化生根培養(yǎng)基
    2.2 材料
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化
            2.2.1.1 培養(yǎng)基
            2.2.1.2 緩沖液
            2.2.1.3 感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.4 大腸桿菌轉化
        2.2.2 農桿菌電轉化感受態(tài)細胞的制備及轉化
            2.2.2.1 培養(yǎng)基
            2.2.2.2 緩沖液
            2.2.2.3 農桿菌電轉化感受態(tài)細胞的制備
            2.2.2.4 農桿菌電轉化
        2.2.3 LiAc法酵母感受態(tài)細胞的制備及轉化
            2.2.3.1 培養(yǎng)基
            2.2.3.2 緩沖液及試劑
            2.2.3.3 酵母感受態(tài)細胞的制備
            2.2.3.4 酵母轉化
                2.2.3.4.1 小樣轉化體系
                2.2.3.4.2 酵母轉化
        2.2.4 發(fā)根農桿菌介導的毛根轉化
            2.2.4.1 培養(yǎng)基
            2.2.4.2 緩沖液及試劑
            2.2.4.3 毛根轉化
                2.2.4.3.1 外植體的獲得
                2.2.4.3.2 農桿菌準備
                2.2.4.3.3 侵染及誘導生根
            2.2.4.4 毛根鑒定
        2.2.5 雙分子熒光互補（BiFc）實驗
            2.2.5.1 原理及觀察
            2.2.5.2 煙草葉片轉化
                2.2.5.2.1 緩沖液及試劑
                2.2.5.2.2 煙草葉片轉化
            2.2.5.3 煙草葉片總蛋白抽提
                2.2.5.3.1 緩沖液
                2.2.5.3.2 煙草葉片總蛋白抽提
        2.2.6 酵母雙雜交實驗
            2.2.6.1 原理
            2.2.6.2 酵母Mating
                2.2.6.2.1 培養(yǎng)基
                2.2.6.2.2 小樣Mating
            2.2.6.3 β-半乳糖苷酶活性檢測
                2.2.6.3.1 緩沖液及試劑
                2.2.6.3.2 β-半乳糖苷酶活性檢測
                2.2.6.3.3 β-半乳糖苷酶活性測定
        2.2.7 標簽融合蛋白質的原核表達及純化
            2.2.7.1 緩沖液及試劑
            2.2.7.2 標簽融合蛋白質原核表達
            2.2.7.3 His-Tag融合蛋白的純化
            2.2.7.4 MBP-Tag融合蛋白的純化
        2.2.8 蛋白質體外相互作用實驗
            2.2.8.1 蛋白質體外Pull-down實驗
            2.2.8.2 蛋白質體外競爭性實驗
            2.2.8.3 Western-Blot
                2.2.8.3.1 緩沖液及試劑
                2.2.8.3.2 Western-Blot
        2.2.9 RNA操作
            2.2.9.1 根總RNA的抽提
            2.2.9.2 cDNA第一鏈合成
        2.2.10 毛根轉化植株接種及結瘤結果統(tǒng)計
3 結果與分析
    3.1 百脈根網格重鏈蛋白
        3.1.1 百脈根網格重鏈蛋白的分離與鑒定
        3.1.2 百脈根網格重鏈蛋白的結構
        3.1.3 網格重鏈蛋白進化分析
    3.2 百脈根網格重鏈蛋白與ROP6 相互作用
        3.2.1 百脈根CHC2 與ROP6 相互作用結構域分析
        3.2.2 百脈根CHC2 與ROP6 體外相互作用
        3.2.3 CHC2 與ROP6 在煙草細胞相互作用
        3.2.4 百脈根CHC2 與ROP6 相互作用的特異性
            3.2.4.1 百脈根ROP6 與CHC2 特異性相互作用
            3.2.4.2 百脈根CHC2 與ROP6 特異性相互作用
    3.3 百脈根網格重鏈蛋白與CLCs相互作用
        3.3.1 百脈根CHC2 與CLCs相互作用
        3.3.2 百脈根CHC2 與CLC1 在煙草細胞相互作用
        3.3.3 CLC1 的磷酸化不影響與CHC2 的體外相互作用
            3.3.3.1 CLC1 在大腸桿菌細胞中被磷酸化
            3.3.3.2 CLC1 是否磷酸化在體外不影響與CHC2 相互作用
    3.4 百脈根CLC1 能競爭ROP6 與CHC2 的相互作用
    3.5 百脈根網格重鏈蛋白時空表達分析
        3.5.1 網格重鏈蛋白組織特異性表達分析
        3.5.2 網格重鏈蛋白在共生早期表達分析
        3.5.3 網格重鏈蛋白在根瘤中的表達分析
    3.6 CHC2 的RNAi影響結瘤數(shù)量
    3.7 CHC2 在百脈根根毛中的定位
        3.7.1 CHC2 在根毛中的定位
        3.7.2 CHC2 與NFR5 共定位
    3.8 總結
4 討論與展望
    4.1 討論
        4.1.1 CHC2 介導受體內吞參與結瘤因子信號傳遞
        4.1.2 ROP6 可能調節(jié)CHC2 的內吞間接參與結瘤因子信號轉導
        4.1.3 磷酸化影響網格蛋白介導的受體內吞
    4.2 展望
參考文獻
附錄 1
附錄 2
附錄 3
附錄 4
致謝



本文編號：3171671