本文關(guān)鍵詞：人胚胎多能干細(xì)胞的分離鑒定和向軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：軟骨是組成人體關(guān)節(jié)和器官的主要成分，由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、Ⅸ型膠原和Ⅺ型膠原)構(gòu)成。軟骨相關(guān)的常見疾病包括先天性軟骨病、外傷和年齡相關(guān)的退行性疾病等。由于軟骨組織缺乏血管和神經(jīng)的分布，以及軟骨細(xì)胞的有絲分裂能力有限，因此軟骨組織的自我修復(fù)機(jī)制受到限制。損傷的軟骨組織修復(fù)后，會(huì)在損傷部位出現(xiàn)一種表達(dá)Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的纖維軟骨，從而替代了正常的軟骨組織，導(dǎo)致軟骨的正常生理功能喪失。 傳統(tǒng)的臨床治療方法并未取得突破性的進(jìn)展。自體和異體軟骨移植雖然解決了非關(guān)節(jié)軟骨的殘損再造，但是有限的軟骨來源依然制約這項(xiàng)技術(shù)的普及。近年來組織工程技術(shù)逐漸被應(yīng)用于軟骨的修復(fù)研究，雖然現(xiàn)在仍然處于初始研究階段，但實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出可以利用的類軟骨組織已經(jīng)成為可能。因此，應(yīng)用干細(xì)胞在治療軟骨損傷領(lǐng)域中取得了很大的關(guān)注。被人們所熟知的種子細(xì)胞包括人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）、成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS），但他們自身也存在著各自的缺點(diǎn)：hESCs具有可以在實(shí)驗(yàn)室條件下長(zhǎng)期培養(yǎng)并維持自我更新的能力，但其形成畸胎瘤的潛在能力限制了它的臨床應(yīng)用；目前關(guān)于ASCs的主要研究集中在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），由于這一類細(xì)胞來源于發(fā)育成熟的個(gè)體，因此具有隨著年齡增長(zhǎng)而增殖能力逐漸下降的缺點(diǎn)，因此決定了該類細(xì)胞在應(yīng)用于組織修復(fù)時(shí)，對(duì)組織的修復(fù)能力是有限甚至是無作用的；iPS是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得的一類可以向多個(gè)方向分化的干細(xì)胞，但由于受到技術(shù)的限制，臨床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)分化的不統(tǒng)一和畸胎瘤，這在一定程度限制了它的應(yīng)用�？傊�，現(xiàn)有的種子細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)方法都不能滿足組織工程的需求，因此為了更好的解決軟骨的修復(fù)問題，我們要尋找一種新的細(xì)胞來源和可以定向誘導(dǎo)組織分化的物質(zhì)。 本課題組前期研究表明：N6,2′-O-二丁�；佘�3′,5′-環(huán)磷酸鈉鹽（N6,2-O-dibutyryl cyclic adenosine3:5-monophosphate，Bt2cAMP）具有誘導(dǎo)軟骨前體細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化的能力。因此在本研究中，我們擬通過選取胎齡在8-12周的自然流產(chǎn)胎兒作為胚胎多能干細(xì)胞的來源，分別從軟骨、羊水和肝組織中獲取人胚胎軟骨多能干細(xì)胞（human embryonic cartilage pluripotent stem cells,hECSCs）、人胚胎羊水多能干細(xì)胞（human embryonic amniotic fluid pluripotentstem cells, hEASCs）和人胚胎肝多能干細(xì)胞（human embryonic hepatic pluripotentstem cells, hEHSCs）并探討B(tài)t2cAMP誘導(dǎo)這三種細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的可能性。為軟骨疾病的治療奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.利用胰酶和膠原酶分步消化法，從8-12周自然流產(chǎn)的胎兒關(guān)節(jié)軟骨分離了一種新的干細(xì)胞，這種干細(xì)胞通過H-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（Fibroblast growth factor4，F(xiàn)GF4）和白血病抑制因子（Leukaemia Inhibitor Factor，，LIF）以及knockout-out培養(yǎng)基和敲除型血清替代物（knockout serum replacement，KSR）的分步驟培養(yǎng)，命名為hECSCs。這種細(xì)胞處于胚胎發(fā)育的早期，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示，它們具有干細(xì)胞典型的細(xì)胞周期，即細(xì)胞大部分停留在G0/G1期，且G0/G1期所占比例經(jīng)歷數(shù)次傳代降低不顯著；表達(dá)hESCs標(biāo)志（OCT4、NANOG、SOX2、SSEA-3和SSEA-4）和ASCs標(biāo)志（CD29、CD44、CD90、CD73和CD105），不表達(dá)hESCs標(biāo)志（TRA-1-60和TRA-1-81）和人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）標(biāo)志（CD117和CD271），另外，也不表達(dá)移植物抗宿主標(biāo)志（CD80，CD40和HLA-DR）。 2.誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明，通過條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)，hECSCs、hEASCs和hEHSCs可以向脂肪細(xì)胞（油紅O染色陽性，表達(dá)PPARG基因）；成骨細(xì)胞（茜素紅染色陽性，堿性磷酸酶陽性和表達(dá)SPP1基因）；軟骨細(xì)胞（阿利新蘭和甲苯胺藍(lán)染色陽性，免疫組織化學(xué)Ⅱ型膠原陽性，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeQuantitative PCR，qPCR）檢測(cè)COL9、COL2A1和SOX9表達(dá)升高；胚層相關(guān)基因TBX5和MEF2C表達(dá)升高；干細(xì)胞相關(guān)基因OCT4、NANOG和TDGF1表達(dá)降低）；神經(jīng)細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞（RT-PCR和western blot分別檢測(cè)到NESTIN，NSE和PDX-1，C-peptide的表達(dá)）分化。細(xì)胞標(biāo)志和分化潛力的實(shí)驗(yàn)都證明這種干細(xì)胞是介于hESCs和ASCs之間的一種細(xì)胞。 3.實(shí)驗(yàn)證明Bt2cAMP可以特異性誘導(dǎo)三種人胚胎多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，并且具有量效依賴關(guān)系。Bt2cAMP濃度在1mM時(shí)達(dá)到最大誘導(dǎo)劑量，使細(xì)胞增殖變緩，并出現(xiàn)從成纖維樣向鋪路石樣的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。形態(tài)改變的細(xì)胞阿利新蘭染色陽性、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性以及qPCR也顯示軟骨相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)和干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)。揭示著，Bt2cAMP是能誘導(dǎo)具有類似分化能力的干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的特異誘導(dǎo)劑。 綜上所述， 1)我們分離了一種新的干細(xì)胞，具有hESCs和MSCs的免疫學(xué)標(biāo)志，分化能力和增殖潛能介于hESCs和hASCs之間，命名為hECSCs。 2)我們成功確定了Bt2cAMP作為一種誘導(dǎo)劑可以特異性的誘導(dǎo)三種不同組織來源的人胚胎多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。 這些發(fā)現(xiàn)都為軟骨修復(fù)提供了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：軟骨 誘導(dǎo)分化 Bt2cAMP 人胚胎多能干細(xì)胞 組織工程
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞表12-16
• 第1章 緒論16-39
• 1.1 軟骨組織和軟骨相關(guān)疾病16-18
• 1.1.1 軟骨組織16-18
• 1.1.2 軟骨相關(guān)疾病18
• 1.2 軟骨疾病的治療和組織工程18-27
• 1.2.1 軟骨相關(guān)疾病的治療18-21
• 1.2.2 干細(xì)胞和臨床應(yīng)用21-27
• 1.3 環(huán)腺苷酸（CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE，CAMP）及其信號(hào)途徑對(duì)細(xì)胞的作用27-36
• 1.4 3-8 周胚胎發(fā)育的關(guān)鍵36-37
• 1.5 立題依據(jù)37-39
• 第2章 hECSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定39-52
• 2.1 材料39-41
• 2.1.1 主要器材和設(shè)備39
• 2.1.2 主要試劑39-40
• 2.1.3 試劑配制40-41
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 2.2.1 hECSCs 的分離41-42
• 2.2.2 hECSCs 的原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)42
• 2.2.3 hECSCs 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇42-43
• 2.2.4 hECSCs 細(xì)胞周期分析43
• 2.2.5 hECSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定43-44
• 2.2.6 hECSCs 細(xì)胞的 RT-PCR 檢測(cè)44-46
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 2.3.1 hECSCs 的培養(yǎng)46-47
• 2.3.2 hECSCs 的細(xì)胞周期分析47-48
• 2.3.3 hECSCs 的細(xì)胞免疫標(biāo)志分析48-49
• 2.3.4 hECSCs 的 RT-PCR 結(jié)果49
• 2.4 討論49-52
• 第3章 hECSCs 的多向分化潛能的鑒定52-76
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料52-56
• 3.1.1 主要器材和設(shè)備52-53
• 3.1.2 主要試劑53-54
• 3.1.3 試劑配制54-55
• 3.1.4 RT-PCR 引物序列55-56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-64
• 3.2.1 hECSCs 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)及檢測(cè)56-58
• 3.2.2 hECSCs 向骨細(xì)胞誘導(dǎo)及檢測(cè)58-59
• 3.2.3 hECSCs 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)及檢測(cè)59-61
• 3.2.4 hECSCs 向胰島細(xì)胞誘導(dǎo)及檢測(cè)61-62
• 3.2.5 hECSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)及檢測(cè)62-64
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-74
• 3.3.1 hECSCs 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果64-66
• 3.3.2 hECSCs 向骨細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果66-68
• 3.3.3 hECSCs 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果68-70
• 3.3.4 hECSCs 向胰島細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果70-71
• 3.3.5 hECSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果71-74
• 3.4 討論74-76
• 第4章 Bt_2CAMP 誘導(dǎo)不同組織來源的胚胎多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化76-88
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料76-78
• 4.1.1 主要器材和設(shè)備76-77
• 4.1.2 主要試劑77
• 4.1.3 RT-PCR 所用引物77-78
• 4.1.4 細(xì)胞來源78
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法78-79
• 4.2.1 Bt_2cAMP 誘導(dǎo) hECSCs 向軟骨細(xì)胞分化78-79
• 4.2.2 Bt_2cAMP 誘導(dǎo) hEHSCs 向軟骨細(xì)胞分化79
• 4.2.3 Bt_2cAMP 誘導(dǎo) hEASCs 向軟骨細(xì)胞分化79
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-86
• 4.3.1 Bt_2cAMP 對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)的劑量依賴關(guān)系79-80
• 4.3.2 阿爾新藍(lán)染色結(jié)果80-82
• 4.3.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)結(jié)果82-85
• 4.3.4 qPCR 結(jié)果85-86
• 4.3.5 hEHSCs 誘導(dǎo)后的 RT-PCR 結(jié)果86
• 4.4 討論86-88
• 第5章 結(jié)論88-89
• 創(chuàng)新點(diǎn)89-90
• 參考文獻(xiàn)90-102
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文102-103
• 致謝103

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐楊俊;趙建寧;;關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2010年08期

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3 王躍春;張洹;;人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力及其向三個(gè)胚層起源細(xì)胞分化的特性[J];生理學(xué)報(bào);2008年03期

4 王勇平;蔣W

本文編號(hào)：294593