本文關鍵詞：三價金屬離子及其配合物對MMPs抑制作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是由細胞分泌的含有鋅金屬離子催化中心的肽鏈內(nèi)切酶。MMPs除了能夠降解細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜外，它們在調(diào)控細胞因子、生長因子、激素和細胞粘附分子受體等的合成和分泌中發(fā)揮重要作用，進而參與發(fā)育、進化、形態(tài)發(fā)生、組織重塑、血管新生、關節(jié)炎、心血管疾病、中風、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退行性疾病、過敏以及癌癥等一系列生理和病理過程。其中MMP-2、-13、-14分別屬于明膠酶類、膠原酶類以及膜型MMPs，它們具有不同的底物降解特異性，能夠降解不同類型膠原和明膠，參與了需要ECM重塑的多個生理或病理過程，其過量表達與腫瘤惡化過程中癌細胞的遷移、浸潤和轉移密切相關。 金屬離子在許多生物過程中發(fā)揮重要作用，如細胞呼吸、信號轉導、存儲和新陳代謝。作為催化酶或維持蛋白質(zhì)結構功能的活性中心發(fā)揮生物功能。破壞金屬離子體內(nèi)平衡涉及很多疾病。但金屬藥物在臨床用于治療各種疾病。并且隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)三價金屬及配合物如瀾系等具有多種生理功能，并且具有抗菌、抗病毒、抗癌活性。 在前期工作中，我們對關白附中抑制MMPs的有效成分研究中發(fā)現(xiàn)，NH4Al(SO4)212H2O對MMP-2、-9抑制的IC501μM，而(NH4)2SO4，K2SO4對MMPs無明顯抑制，推斷其抑制作用的活性基團是三價鋁。同時，在對細胞的存活能力不產(chǎn)生影響的濃度下，NH4Al(SO4)212H2O顯示了對HT-1080細胞浸潤和遷移能力的劑量依賴性抑制。我們進而分析了幾種三價的金屬離子、三價金屬的配合物如Fe2(SO4)3、FeCl3、NH4Fe(SO4)2以及K3[Fe(CN)6]對MMP-16的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這幾種三價金屬鹽或其配合物對MMP-16的活性、細胞的遷移和侵襲能力均有比較顯著的影響。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎上，進一步探討眾多三價金屬離子、三價金屬離子的配合物對MMPs的抑制是否具有普遍性、對MMPs家族成員的抑制是否具有特異性、抑制MMPs活性的分子機制、對其它蛋白酶家族的成員是否也存在一定的抑制作用，這是本論文試圖回答或部分回答的主要問題。 在本研究中，我們選擇了12種具有代表性的三價金屬離子及其配合物，分析了對三種不同類型的重組MMPs，MMP-2、-13、-14的抑制作用。結果表明，瀾系的LaCl3、TbCl3、GdCl3、YbCl3、EuCl3對MMP-2、-13以及-14均有不同程度的抑制作用，IC5010μM左右。K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212H2O四種試劑對三種MMPs的酶活抑制IC5010μM，，K3[Fe(CN)6]抑制效果尤為顯著，IC50分別為2.2μM、0.88μM、0.05μM。其他三價金屬離子化合物YCl3、HAuCl4、NaAuCl4對的三種MMPs的IC5010μM，HAuCl4對MMP-14抑制效果尤為顯著，IC50值為0.3μM。同時，終濃度為10μM的K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)2、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3、HAuCl4、NaAuCl4對Cathepsin （組織蛋白酶）K、L均無明顯抑制，但對于Cathepsin B有抑制，而K3[Fe(CN)6]與HAuCl4對上述三種Cathepsin均無明顯抑制。另外，我們發(fā)現(xiàn)CaCl2、NiCl2、MnCl2、ZnSO4、CoCl2、NiCl2等二價金屬離子在100μM對三種MMPs并不抑制。上述結果表明，三價金屬及其配合物對MMPs具有普遍的抑制作用，而K3[Fe(CN)6]與HAuCl4對MMPs家族的MMP-14具有特異性抑制作用。另外，三價金屬及配合物對HT-1080細胞活力的作用分析表明，F(xiàn)eCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212·H2O、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3降低細胞活性的IC50值均大于350μM。并且，我們發(fā)現(xiàn)在0-350μM隨著化合物濃度的增加，并沒有明顯的細胞毒趨勢，而濃度大于350μM時，細胞活力驟然降低，推測可能是由于細胞對于這些三價離子的通透性突然增強，從而進入細胞中最終導致細胞死亡，細胞活力下降。 我們隨后選取了對MMP-14具有特異性抑制，并且抑制效果較強的K3[Fe(CN)6]，分析了其對MMP-14抑制機制及抑制類型。并進一步檢測了K3[Fe(CN)6]對腫瘤細胞行為的影響，最后對調(diào)節(jié)細胞行為的機制進行了初步探討。酶動力學分析表明，K3[Fe(CN)6]在終濃度0-0.06μM范圍內(nèi)對MMP-14的抑制為可逆抑制機制。通過Michaelis-Menten方程、Lineweaver-Burk方程以及Dixonplots作圖表明，當抑制濃度為0.0157μM時，Km不變，Vmax變小，屬于非競爭性抑制，但隨著濃度增加為0.0313μM、0.0625μM時Km變小，Vmax變小，屬于非競爭與反競爭混合型抑制類型。表明底物和抑制劑可以同時與酶結合，形成的中間三元復合物影響酶的構象和催化能力，因此酶活力降低。同時，我們發(fā)現(xiàn)了K4[Fe(CN)6]對MMP-14具有顯著地抑制作用以及一致抑制機制，比較其他活性基團發(fā)現(xiàn)抑制的活性中心為Fe-CN的配合物。進一步細胞實驗表明，在不影響細胞活力的濃度下，K3[Fe(CN)6](0-50μM)對腫瘤細胞HT-1080的遷移和侵襲具有顯著抑制作用。免疫印跡實驗表明，0-50μM的K3[Fe(CN)6]抑制細胞的浸潤和遷移，可能與對MMP-14表達的下調(diào)相關。進一步實驗表明，K3[Fe(CN)6]對HT-1080細胞中Erk1/2、-catenin、P-JNK、FAK蛋白表達下調(diào)，推測可能是通過對上述的蛋白調(diào)控，進而抑制了細胞的遷移和侵潤。具體的調(diào)控機制與信號傳遞有待進一步研究。 最后，我們針對HAuCl4對MMP-14的特異性抑制機制及類型進行了分析。并進一步分析了其對腫瘤細胞行為的影響。結果表明，HAuCl4對MMP-14的抑制機制為可逆抑制。Michaelis-Menten方程作圖以及Lineweaver-Burk方程和Dixon plots作圖表明，隨著濃度增加，Km不變，Vmax變小，HAuCl4在0-0.6μM濃度范圍內(nèi)對MMP-14抑制屬于非競爭抑制，即底物和HAuCl4對MMP-14的作用不存在競爭的關系，MMP-14與底物或者HAuCl4結合都不影響與另外一個的結合，形成的中間三元復合物可能影響酶的構象和催化能力，因此導致酶活力降低。并且作用的部位為活性部位以外的基團，其結構與底物無共同之處，不能通過增加底物濃度來解除抑制。細胞實驗表明，HAuCl4在不影響細胞活力的濃度下0-50μM，對腫瘤的遷移和侵襲具有顯著抑制作用。提示HAuCl4可能通過抑制MMP-14活性進而對腫瘤細胞行為起作用。進一步發(fā)現(xiàn)，NaAuCl4盡管也顯示對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、13、14具有抑制作用，并且對組織蛋白酶不抑制，但與HAuCl4相比抑制作用較弱，尤其是對MMP-14，失去了抑制的選擇性。另外，NaAuCl4對HT-1080細胞活力影響的IC50較高，在和HAuCl4同樣濃度下，表現(xiàn)出了促進細胞侵襲的現(xiàn)象。對于造成這一差異的原因還需進一步研究。 綜上所述，本論文首次發(fā)現(xiàn)并證實了，三價金屬離子及配合物對MMPs具有普遍的抑制作用，且抑制IC50在微摩爾級，這種抑制可能通過調(diào)節(jié)MMPs的功能進而調(diào)節(jié)MMPs參與的相關生理病理性活動。以往的MMPs抑制劑的研究都局限在有機分子的范圍內(nèi)，我們的發(fā)現(xiàn)對MMPs抑制劑研究范圍的擴展具有重要的理論意義。并且其中K3[Fe(CN)6]和HAuCl4兩種化合物對MMP-14均具有特異性的抑制作用，抑制機制分別為非競爭-反競爭混合型可逆性抑制、非競爭性抑制，表明兩者是通過與MMP的非活性中心結合，可能通過改變其結構、構象進而實現(xiàn)抑制的，對此目前尚未有報道。最后我們還發(fā)現(xiàn)了K3[Fe(CN)6]與HAuCl4能夠對腫瘤細胞HT1080的細胞行為的影響，尤其是K3[Fe(CN)6]，可能通過抑制MMP-14的活性和表達以及腫瘤相關的多種信號蛋白而抑制腫瘤的遷移和侵襲。綜上，本論文的研究對于了解三價金屬離子及其配合物在調(diào)節(jié)MMPs的活性，調(diào)節(jié)MMPs參與的相關生理病理活動中的作用具有重要的意義。
【關鍵詞】：基質(zhì)金屬蛋白酶 三價金屬離子及其配合物 抑制機制 腫瘤
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 第一章 緒論16-50
• 1 基質(zhì)金屬蛋白酶16-38
• 1.1 基質(zhì)金屬蛋白酶家族簡介16
• 1.2 基質(zhì)金屬蛋白酶結構及分類16-19
• 1.3 MMPs 的活化與調(diào)控19-23
• 1.3.1 轉錄調(diào)節(jié)19-21
• 1.3.2 酶原形式 MMPs 的活化21-22
• 1.3.3 MMPs 活性的激活與抑制22-23
• 1.4 MMPs 的生理與病理作用23-36
• 1.4.1 MMPs 的生理功能23-26
• 1.4.2 MMPs 與腫瘤26-31
• 1.4.3 MMPs 與非腫瘤相關疾病31-36
• 1.5 MMPs 抑制劑36-38
• 2 金屬離子及配合物38-47
• 2.1 金屬離子生物功能38-39
• 2.2 金屬離子與疾病39-40
• 2.3 金屬及其配合物藥物發(fā)展40-41
• 2.4 三價金屬及配合物41-47
• 2.4.1 鐵鋁及其配合物41-44
• 2.4.2 瀾系及其配合物的生物功能44-45
• 2.4.3 其他三價陽離子化合物及其配合物45-47
• 3 本論文研究目的和策略47-50
• 第二章 材料與方法50-60
• 1 材料50-53
• 1.1 菌種與細胞株以及抗體50
• 1.2 儀器50
• 1.3 試劑50-53
• 1.3.1 包涵體分離純化試劑50-51
• 1.3.2 SDS-PAGE 電泳試劑51-52
• 1.3.3 銀染試劑52-53
• 1.3.4 包涵體處理試劑53
• 2 方法53-60
• 2.1 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 的表達、純化及復性53-54
• 2.1.1 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 的誘導表達53-54
• 2.1.2 包涵體的分離和洗滌54
• 2.1.3 包涵體的溶解54
• 2.1.4 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 包涵體的純化54
• 2.2 金屬離子及其配合物對 MMPs 酶活力影響54-55
• 2.2.1 金屬離子及其配合物對 MMPs 活性的影響54-55
• 2.2.2 金屬離子及其配合物對組織蛋白酶 B、K、L 活性的影響4055
• 2.2.3 酶活性的抑制 IC50測定55
• 2.3 酶動力學分析55-56
• 2.3.1 酶活性抑制機制分析55-56
• 2.3.2 抑制劑對酶的抑制類型分析56
• 2.4 細胞培養(yǎng)56-57
• 2.4.1 細胞復蘇56
• 2.4.2 細胞傳代56
• 2.4.3 細胞凍存56-57
• 2.5 細胞活力檢測（MTT 法）57
• 2.6 細胞遷移實驗（劃痕法）57
• 2.7 細胞侵襲試驗57-58
• 2.8 免疫印跡58-60
• 第三章 結果與討論60-104
• 1 三價金屬離子及其配合物對MMPs的抑制作用60-80
• 1.1 三價金屬及其配合物對重組蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的 IC50測定60-76
• 1.1.1 重組蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的活性鑒定60-62
• 1.1.2 幾種瀾系金屬化合物對 MMP-2、-13、-14 酶活性抑制62-65
• 1.1.3 三價鐵及鋁化合物及其配合物對 MMP-2、-13、-14 酶學抑制（IC50）65-68
• 1.1.4 其他三價金屬及其配合物對 MMP-2、-13、-14 酶活性抑制（IC50）68-76
• 1.2 三價金屬離子及配合物對 HT-1080 細胞活力的影響76-78
• 1.3 小結78-80
• 2 K_3[Fe(CN)_6]對MMP-14的抑制機制研究80-94
• 2.1 K_3[Fe(CN)_6]對 MMP-14 的抑制機制與類型80-84
• 2.2 K_3[Fe(CN)_6]抑制 MMP-14 酶活力的活性基團分析84
• 2.3 K_3[Fe(CN)_6]對 HT-1080 細胞活力的影響84-86
• 2.4 K_3[Fe(CN)_6]對 HT-1080 細胞遷移能力的影響86-87
• 2.5 K_3[Fe(CN)_6]對 HT-1080 細胞侵襲能力的影響87-89
• 2.6 K_3[Fe(CN)_6]對 HT1080 細胞中 MMP-14 表達的影響89-90
• 2.7 K_3[Fe(CN)_6]對多種細胞信號蛋白的影響90-92
• 2.8 小結92-94
• 3 HAuCl_4對MMP-14酶活性抑制作用及機制研究94-100
• 3.1 HAuCl_4對 MMP-14 抑制機制與抑制類型94-96
• 3.2 HAuCl_4對 HT-1080 細胞活力的影響96-98
• 3.4 HAuCl_4對 HT-1080 細胞侵襲能力的影響98-99
• 3.5 小結99-100
• 4 結論100-104
• 參考文獻104-128
• 作者簡介及攻讀博士期間所取得的科研成果128-130
• 致謝130

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 封旭光;胡驥瓊;;血管形成在血管瘤中的表達及研究進展[J];安徽醫(yī)學;2010年12期

2 任志;汪強武;王啟之;;胃癌組織中端粒酶活性與基質(zhì)金屬蛋白酶-7表達的檢測及其臨床意義[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2012年02期

3 ;Role of Epstein-Barr Virus Encoded Latent Membrane Protein 1 in the Carcinogenesis of Nasopharyngeal Carcinoma[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年03期

4 潘湘陽;李紅彥;姚雪;熊冬梅;陳俊霞;;核糖核酸酶抑制因子過表達抑制B16細胞的侵襲和轉移[J];第三軍醫(yī)大學學報;2012年04期

5 馮智英;莫祥蘭;邵春奎;蘇組蘭;;黏膜NK/T和成熟T細胞淋巴瘤MMP9表達及其與EBV感染的關系[J];南方醫(yī)科大學學報;2007年09期

6 馬猛;曲顯俊;;Ⅳ型膠原酶與腫瘤的侵襲和轉移[J];兒科藥學雜志;2008年02期

7 曾維忠;鄧凌燕;周銳;;靶向MMP-9脫氧核酶抑制人肺腺癌細胞的粘附與遷移的實驗研究[J];中國肺癌雜志;2008年06期

8 劉志東;許紹發(fā);肖寧;宋長興;張海青;李福根;;IL-8和MMP-9在非小細胞肺癌患者組織及血清中表達水平的研究[J];中國肺癌雜志;2010年08期

9 陳秋鳳;周防震;;明膠酶檢測方法研究進展[J];湖北民族學院學報(醫(yī)學版);2012年01期

10 高穎;郭青龍;;千層紙素抗腫瘤作用的研究進展[J];福建醫(yī)藥雜志;2009年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張宗堯;張徐祥;楊柳燕;;微囊藻毒素MC-LR 270d暴露對小鼠肝臟損傷以及MMP-2/-9表達的影響[A];第六屆全國環(huán)境化學大會暨環(huán)境科學儀器與分析儀器展覽會摘要集[C];2011年

2 孫保存;趙秀蘭;孫濤;車娜;孫丹;趙楠;董學易;古強;;Twist1增強基質(zhì)金屬蛋白酶活性促進肝癌轉移[A];中華醫(yī)學會病理學分會2010年學術年會日程及論文匯編[C];2010年

3 張穎;Yuanyuan Zhang;Yun Xie;Yonggang Gao;Juanjuan Ma;Jie Yuan;Juan Li;Jiangyan Wang;Lei Li;Jianping Zhang;Li Chu;;丹參對鐵超載肝纖維化的多靶點抑制作用(英文)[A];第十一屆全國博士生學術年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，大會報告）[C];2013年

4 Yanzhe Xia;Jie Chen;Yuan Cao;ChenshuXu;Ruiming Li;Yuhua Pan;Xiao Chen;;Wedelolactone exhibits anti-fibrotic effects on human hepatic stellate cell line LX-2[A];2014年廣東省藥師周大會論文集[C];2014年

5 范彬;馬禮坤;;血小板源性生長因子及其受體在心血管疾病中的作用[A];全國第十三屆心臟學會、第十六屆心功能專業(yè)委員會和《心臟雜志》編委會聯(lián)合學術大會會議摘要[C];2013年

6 吳微;胡佳;周宜開;;鎘的毒性機理及其作用機制[A];2014中國環(huán)境科學學會學術年會論文集（第八、九章）[C];2014年

7 沈秉正;宋金春;喻研;陳姣;張伶莉;彭燕;肖宇博;;人源全長MMP-9型基質(zhì)金屬蛋白酶的原核表達及活性研究[A];第十二屆全國青年藥學工作者最新科研成果交流會論文集[C];2014年

8 齊欣;李建新;;聯(lián)合檢測心衰超聲指數(shù)與基質(zhì)金屬蛋白酶-9對評價慢性腎衰合并心衰患者臨床價值的探討[A];全國高血壓防治知識推廣培訓班暨健康血壓中國行海南�？跁撐木C合刊[C];2014年

9 王越;金京一;;硝基類基質(zhì)金屬蛋白酶-7抑制劑研究(2)[A];全國第十七屆大環(huán)化學暨第九屆超分子化學學術研討會論文摘要集[C];2014年

10 楊明e

本文編號：282566