本文關鍵詞：亞細胞靶向的DNA及信號肽修飾SiO_2包被熒光納米探針，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著分子生物學和生物醫(yī)學的快速發(fā)展以及生物分析技術的不斷提高,單個細胞內(nèi)不同細胞器區(qū)域的生理活動逐漸發(fā)展成為研究熱點。單個細胞內(nèi)各種小分子亞細胞區(qū)域分布和濃度情況對維持細胞的正常形態(tài)及生理活動至關重要,特別是細胞內(nèi)pH和鈣離子的分布與許多生命活動,如細胞增殖、離子運輸、胞吞作用、肌肉收縮等息息相關。因此在亞細胞水平對重要信號分子的實時、動態(tài)監(jiān)測,對生命科學和生物醫(yī)學研究具有重要的意義。熒光分析技術以其靈敏度高,選擇性好,分析特征參數(shù)多,操作簡便等優(yōu)點在生物檢測和生物成像領域備受矚目。目前,熒光分析技術主要依靠種類豐富、技術成熟的有機小分子熒光探針,但是有機小分子熒光探針往往合成過程復雜、抗光漂白能力差、后期靶向修飾困難等缺點,限制了其在生物檢測領域的深入應用。近年來,隨著納米技術的快速發(fā)展,熒光納米探針以其合成簡單、光學性質(zhì)可調(diào)、便于后期修飾等優(yōu)點引起人們的廣泛關注。相比于傳統(tǒng)有機小分子熒光探針,熒光納米探針通常亮度更高、光穩(wěn)定性更好。另外,隨著現(xiàn)在納米制備技術的提高,對納米粒子尺度的精確控制及對其功能化手段的不斷完善,很大程度上使熒光納米探針滿足了生物檢測和亞細胞區(qū)域生物成像等領域的要求。因此,本論文基于DNA納米機器和二氧化硅納米微膠囊,設計合成了多種熒光納米探針,并應用于亞細胞區(qū)域pH及Ca2+濃度和時空分布的實時、動態(tài)監(jiān)測,分別開展了以下幾方面的工作:(1)pH敏感DNA納米機器的設計合成及分析應用。基于DNA duplex-triplex轉換,設計合成了一種pH敏感的比率型DNA熒光納米機器t-switch。在pH=5.3-6.0范圍內(nèi),t-switch的熒光信號與pH值有良好的線性響應關系;并且在pH循環(huán)下,t-switch的打開和關閉響應迅速,瞬時完成,經(jīng)過多次循環(huán)仍保持穩(wěn)定的性能;更重要的是,與已報道的大多數(shù)DNA納米機器不同,t-switch不需要轉染試劑輔助即可在15分鐘內(nèi)被細胞攝取,為細胞內(nèi)pH梯度變化的實時動態(tài)監(jiān)測奠定了基礎。(2)溶酶體靶向的pH敏感PEI/DNA complexes復合納米機器的設計合成及分析應用。利用PEI與t-switch的靜電作用,設計合成了靶向溶酶體的PEI/DNA complexes。該復合納米機器具有t-switch相似的pH敏感性能,而工作范圍擴展到pH=4.6-7.8。研究發(fā)現(xiàn),該復合納米機器可通過細胞胞吞途徑進入細胞溶酶體中,并保護DNA骨架免受DNA酶的破壞。在細胞成像實驗中成功實現(xiàn)了對溶酶體不同生理階段中pH變化的實時、動態(tài)監(jiān)測。(3)線粒體靶向Ca2+熒光納米探針的設計合成及分析應用。本文采用反相微乳液法將Ca2+熒光探針Fluo-4包裹入氨基化二氧化硅納米微膠囊,制備成Ca2+熒光納米探針,并在其表面修飾具有線粒體靶向定位功能的信號肽,使其成功定位于線粒體內(nèi),得到了能夠靶向線粒體的Ca2+熒光納米探針,為線粒體內(nèi)Ca2+濃度變化的實時監(jiān)測奠定了基礎。(4)線粒體靶向和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向雙波長比率Ca2+熒光納米探針的設計合成及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度變化的同步監(jiān)測。利用反相微乳液法將低親和力,工作范圍在mmol水平的鈣離子探針STDBT包入二氧化硅納米微膠囊,通過表面信號肽修飾和引入對Ca2+不響應的惰性染料參比,設計合成了線粒體Ca2+熒光納米探針(CFNP-M)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙波長比率Ca2+熒光納米探針(CFNP-E),實現(xiàn)了對線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度瞬變的同步、實時、動態(tài)監(jiān)測,為探索Ca2+在調(diào)節(jié)細胞功能中的作用機制提供了新方法。
【關鍵詞】：pH探針 鈣離子探針 DNA納米機器 二氧化硅納米微球 信號肽 實時生物成像
【學位授予單位】：北京理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q-33;TB383.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-42
• 1.1 概述12-13
• 1.2 熒光納米探針13-30
• 1.2.1 無機發(fā)光納米粒子13-17
• 1.2.2 熒光高分子納米微球17-20
• 1.2.3 生物熒光納米探針20-30
• 1.3 細胞內(nèi)溶酶體pH的檢測30-37
• 1.3.1 監(jiān)測溶酶體內(nèi)pH的傳感器研究進展30-32
• 1.3.2 pH敏感DNA納米機器32-37
• 1.4 細胞內(nèi)游離Ca~(2+)的檢測37-40
• 1.4.1 Ca~(2+)的細胞內(nèi)分布和生理功能37-39
• 1.4.2 細胞內(nèi)游離Ca~(2+)檢測方法39-40
• 1.5 本論文的選題思路和研究目標40-42
• 第2章 基于Triplex結構pH敏感的DNA納米機器42-54
• 2.1 引言42
• 2.2 DNA納米機器的設計合成42-44
• 2.3 實驗部分44-45
• 2.3.1 試劑及儀器44
• 2.3.2 DNA納米機器的合成及測試44-45
• 2.3.3 細胞培養(yǎng)及共聚焦顯微熒光成像45
• 2.4 結果與討論45-52
• 2.4.1 pH對DNA納米機器（t-switch）熒光性質(zhì)的影響45-48
• 2.4.2 DNA納米機器（t-switch）用于細胞內(nèi)pH變化監(jiān)測48-52
• 2.5 本章小結52-54
• 第3章 pH敏感的PEI/DNA complexes復合納米機器54-66
• 3.1 引言54
• 3.2 PEI/DNA complexes復合納米機器的設計原理54-55
• 3.3 實驗部分55-57
• 3.3.1 試劑及儀器55-56
• 3.3.2 PEI/DNA complexes復合納米機器的合成及測試56
• 3.3.3 細胞培養(yǎng)及共聚焦顯微熒光成像56-57
• 3.4 結果與討論57-64
• 3.4.1 不同N/P比對PEI/DNA complexes尺寸的影響57
• 3.4.2 pH對PEI/DNA complexes熒光性質(zhì)的影響57-60
• 3.4.3 PEI/DNA complexes用于監(jiān)測溶酶體內(nèi)pH變化60-61
• 3.4.4 t-switch及PEI/DNA complexes細胞內(nèi)在化途徑的研究61-64
• 3.5 本章小結64-66
• 第4章 信號肽介導的線粒體鈣熒光納米探針66-78
• 4.1 引言66
• 4.2 信號肽介導的鈣熒光納米探針的制備原理66-68
• 4.2.1 成核原理66-67
• 4.2.2 包殼原理67
• 4.2.3 信號肽修飾67-68
• 4.3 實驗部分68-71
• 4.3.1 儀器及試劑68-69
• 4.3.2 信號肽介導的核殼鈣熒光納米探針(FSiNPs-Peptide)的制備69-70
• 4.3.3 鈣熒光納米探針的表征70
• 4.3.4 熒光性能測試70-71
• 4.3.5 激光共聚焦熒光顯微成像71
• 4.4 結果與討論71-76
• 4.4.1 鈣熒光納米探針的形貌分析71-72
• 4.4.2 鈣離子熒光納米探針的表征72-73
• 4.4.3 鈣熒光納米探針（FSi NPs-Peptide）對Ca~(2+)響應性能73-74
• 4.4.4 激光共聚焦熒光顯微成像74-76
• 4.5 本章小結76-78
• 第5章 信號肽介導線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的鈣熒光納米探針78-86
• 5.1 引言78
• 5.2 亞細胞靶向Ca~(2+)熒光納米探針的設計原理78-79
• 5.3 實驗部分79-81
• 5.3.1 儀器及試劑79-80
• 5.3.2 包被STDBT的靶向型鈣熒光納米探針的制備80
• 5.3.3 鈣離子熒光納米探針的表征80-81
• 5.4 結果與討論81-85
• 5.4.1 STDBT HPLC純化條件的探索81
• 5.4.2 靶向型鈣熒光納米探針對Ca~(2+)響應性能81-83
• 5.4.3 靶向型鈣熒光納米探針對亞細胞Ca~(2+)濃度的監(jiān)測83-85
• 5.5 本章小結85-86
• 結論86-88
• 參考文獻88-100
• 附錄100-102
• 攻讀博士學位期間發(fā)表學術論文情況102-103
• 致謝103-104
• 作者簡介104

  本文關鍵詞：亞細胞靶向的DNA及信號肽修飾SiO_2包被熒光納米探針，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：269072