本文關鍵詞：Shewanella oneidensis呼吸作用對生物被膜形成的影響及其分子基礎研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然環(huán)境中,細菌能以多種方式生存并通過響應周圍不斷變化的環(huán)境條件,改變其原有的生活方式。當細菌群體的細胞濃度較高時,細菌可以在非生物或者活性表面形成固體生物被膜(solid-surface associated biofilm, biofilm),也能聚集在氣液分界面形成氣液生物被膜(air-liquid interface biofilm, pellicle)。細菌生物被膜的形成由一系列復雜的生物化學過程組成,并受到環(huán)境因素的影響和調控。本課題的研究對象Shewanella oneidensis是一種革蘭氏陰性的兼性厭氧菌,能夠利用一系列無機物和有機物作為電子受體進行呼吸并廣泛分布于各種自然環(huán)境中。之前關于S. oneidensis的研究中,在培養(yǎng)基中加入金屬螫合劑EDTA能夠顯著降低其氣液生物被膜的生物量,并且生物被膜的形成在EDTA濃度為0.3mM時完全被抑制,該現象表明二價金屬陽離子在氣液生物被膜的成熟中起到重要作用。本研究中,我們以二價陽離子對氣液生物被膜的影響為切入點,將S.oneidensis菌株培養(yǎng)于添加了不同二價金屬陽離子的24孔板內,隨后觀察記錄氣液生物被膜的形成情況,發(fā)現二價鐵離子對氣液生物被膜的形成具有特殊的影響。研究結果表明,少量的Fe2+對于氣液生物被膜的形成是必要的,而過量的鐵離子(0.3 mM Fe2+或Fe3+)會導致氣液生物被膜的解體,但并不影響細菌的有氧生長。通過一系列的實驗我們進一步證明,鐵離子對氣液生物被膜的破壞是由于在該培養(yǎng)條件下,S. oneidensis介導了不可溶電子受體鐵氧化合物(Fe3O4、Fe2O3等)的形成。當含Fe3+的鐵氧化合物形成時,部分有能力形成氣液生物被膜的細菌傾向于在不可溶電子受體表面形成固體生物被膜,并且優(yōu)先利用該電子受體進行呼吸。本課題深入探討了鐵對S. oneidensis氣液生物被膜產生的影響,表明其特殊的呼吸機制決定了它對于不同呼吸底物的選擇,以及由此產生的生存方式的轉變。由于之前的研究已經對S. oneidensis的無氧呼吸做了較為深入的探討,因此本課題以上述結論作為出發(fā)點,著眼于有氧呼吸和微氧呼吸中所涉及的末端氧化酶,對S. oneidensis獨特的呼吸系統(tǒng)和呼吸調控機制進行了深入研究。與大多數細菌類似,S. oneidensis擁有多種終端氧化酶,包括兩個血紅素-銅氧化酶(caa3型和cbb3型)和一個bd型醌醇氧化酶。S. oneidensis能夠在富含層化電動勢化合物的環(huán)境中生存,其中的分子機理是本研究將要探討的另一個重要問題。研究中我們發(fā)現cbb3型細胞色素氧化酶在有氧呼吸中占主導地位；而微氧條件下,除cbb3型細胞色素氧化酶之外,bd型醌醇氧化酶也起到重要作用。與此相反,與線粒體氧化酶同源的caa3型細胞色素氧化酶表達量極低,使它在S. oneidensis中幾乎不發(fā)揮作用。此外,cbb3型細胞色素氧化酶和bd型醌醇氧化酶的表達受Crp (cAMP受體蛋白)的調控。這些發(fā)現表明,S. oneidensis對不同氧化還原環(huán)境的適應性來自呼吸調控系統(tǒng)的轉換以及caa3型細胞色素氧化酶的功能缺失。綜上所述,本研究以二價金屬離子對S. oneidensis氣液界面生物被膜的影響為出發(fā)點,探討了S. oneidensis獨特的呼吸系統(tǒng)對電子受體選擇以及生存方式轉變過程的影響,并且對其獨特的終端氧化酶體系以及呼吸調控系統(tǒng)進行了深入研究。
【關鍵詞】：Shewanella oneidensis 氣液生物被膜 細胞色素末端氧化酶 呼吸調控系統(tǒng) Crp蛋白
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 緒論14-29
• 1.1 細菌生物被膜概述14-19
• 1.1.1 細菌生物被膜的結構特征14-17
• 1.1.2 細菌生物被膜的生長周期17-19
• 1.2 氣液生物被膜中的金屬離子19-20
• 1.3 S. oneidensis的末端氧化酶及其調控系統(tǒng)20-26
• 1.3.1 細胞色素氧化酶概述21
• 1.3.2 細菌中的末端氧化酶21-25
• 1.3.3 S. oneidensis的末端氧化酶25-26
• 1.4 本研究的背景、主要內容及意義26-29
• 2 二價金屬陽離子對S. oneidensis氣液生物被膜的影響29-56
• 2.1 材料與方法29-35
• 2.1.1 化學藥品和試劑29-31
• 2.1.2 供試菌株、質粒以及培養(yǎng)條件31-32
• 2.1.3 框內缺失突變株的構建與回補32-33
• 2.1.4 氣液生物被膜的培養(yǎng)及生物量的測定33
• 2.1.5 β-半乳糖苷酶活性檢測33-34
• 2.1.6 通過Ferrozine試驗測定鐵的氧化物中Fe~(2+)和Fe~(3+)的比例34-35
• 2.2 結果與分析35-51
• 2.2.1 S. oneidensis氣液生物被膜的形成需要二價金屬陽離子35-39
• 2.2.2 Mg~(2+)和Fe~(2+)對于氣液生物被膜的形成是必要的39-43
• 2.2.3 Fe~(2+)的氧化對氣液生物被膜形成的影響43-46
• 2.2.4 不可溶電子受體能夠破壞S. oneidensis的氣液生物被膜46-50
• 2.2.5 鐵離子對△cymA和△crp的氣液生物被膜沒有影響50-51
• 2.3 討論51-56
• 2.3.1 Fe~(2+)對S. oneidensis氣液生物被膜的影響52-53
• 2.3.2 鐵氧化合物的形成能夠破壞S. oneidensis氣液生物被膜53-54
• 2.3.3 S. oneidensis傾向于在不可溶電子受體表面形成固體生物被膜54-56
• 3 c型細胞色素在有氧呼吸中起到關鍵作用56-72
• 3.1 材料與方法56-61
• 3.1.1 供試菌株、質粒以及培養(yǎng)條件56-57
• 3.1.2 框內缺失突變株的構建與回補57-58
• 3.1.3 S. oneidensis有氧培養(yǎng)及生長速率測定58
• 3.1.4 Nadi試驗58-59
• 3.1.5 生理特性研究59
• 3.1.6 存活率試驗59
• 3.1.7 啟動子活性檢測59-60
• 3.1.8 qRT-PCR60-61
• 3.2 結果與分析61-69
• 3.2.1 細胞色素c蛋白在有氧生長中的重要作用61-63
• 3.2.2 細胞色素cbb_3氧化酶在S. oneidensis的有氧呼吸中至關重要63-65
• 3.2.3 細胞色素cbb_3氧化酶和細胞色素bd氧化酶在微氧呼吸中起到關鍵作用65-66
• 3.2.4 S. oneidensis末端氧化酶在呼吸中的功能與表達水平有關66-68
• 3.2.5 cyd操縱子的補償表達68-69
• 3.3 討論69-72
• 3.3.1 S. oneidensis在有氧條件下主要利用cbb_3型氧化酶進行呼吸69-70
• 3.3.2 S. oneidensis中細胞色素caa_3氧化酶功能喪失70-72
• 4 S. oneidensis呼吸系統(tǒng)的調控72-81
• 4.1 材料與方法72-74
• 4.1.1 供試菌株、質粒以及培養(yǎng)條件72-73
• 4.1.2 啟動子活性檢測73
• 4.1.3 Crp-His融合蛋白的表達純化73-74
• 4.1.4 EMSA試驗74
• 4.2 結果與分析74-78
• 4.2.1 全局調控因子ArcA,Crp和Fnr對cco,cox以及cyd操縱子表達的影響74-76
• 4.2.2 Crp蛋白的DNA結合特征76-78
• 4.3 討論78-81
• 5 論文總結81-85
• 5.1 主要研究結論81-83
• 5.2 創(chuàng)新之處83
• 5.3 不足及展望83-85
• 參考文獻85-98
• 附錄98-101
• 致謝101-103
• 作者簡介103-104

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