【摘要】：α-半乳寡糖在自然界中廣泛存在,具有許多重要的生物學(xué)功能,在功能食品及醫(yī)藥業(yè)有著重要的應(yīng)用價(jià)值。例如,豆奶中的不易消化的a-半乳寡糖及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物通常包含Galα1-6糖苷鍵,這些物質(zhì)不易被人或其他單胃動(dòng)物消化,可以作為益生元(prebiotics)進(jìn)入腸道選擇性的促進(jìn)腸道有益菌群的生長(zhǎng)。α-Gal抗原寡糖是一類(lèi)末端含有Galα1-3糖苷鍵的糖鏈,是在非靈長(zhǎng)類(lèi)、原猴亞目、新世界猴等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的重要的糖抗原。在進(jìn)行異種器官移植時(shí),該抗原進(jìn)入人體后可被人體內(nèi)的天然α-Gal抗體識(shí)別而引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),甚至危及患者生命。在進(jìn)行異種器官移植時(shí),向患者體內(nèi)大量注射人工合成的α-Gal抗原寡糖或其衍生物能中和天然抗體,減弱免疫排斥反應(yīng)。另外,正由于人體中存在天然的α-Gal抗體,α-Gal抗原寡糖也可以用于癌癥疫苗的制備,以增加癌癥疫苗的免疫原性。另一種重要的α-半乳寡糖globotriose (Galα1-4Galβ1-4Glc),存在于人體細(xì)胞表面,是痢疾志賀氏桿菌(Shigella dysenteriae)和腸出血性大腸桿菌(EPEC)產(chǎn)生的志賀氏毒素的受體糖鏈,志賀氏毒素與globotriose結(jié)合會(huì)引起一系列毒性反應(yīng)及并發(fā)癥,最終引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)導(dǎo)致患者死亡人工合成的globotriose及其衍生物可以模擬天然受體結(jié)構(gòu)并與毒素結(jié)合,可以作為親和抑制劑用于中和毒素及相關(guān)疾病的治療。此外,globotriose還是存在于腦癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌及小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂如GloboH和SSEA4糖鏈的核心結(jié)構(gòu),因此可作為癌癥相關(guān)糖抗原的合成前體用于癌癥疫苗的研發(fā)。最近的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞表面或者可溶性的Pk/Gb3組織血型抗原末端的半乳雙糖(Galα1-4Gal)結(jié)構(gòu)或者類(lèi)似物可以通過(guò)與HIV-1病毒的包膜蛋白結(jié)合以抑制病毒在靶細(xì)胞表面的吸附,揭示了globotriose及其衍生物可以作為新的治療方法用于HIV/AIDS的治療的可能。雖然寡糖及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物應(yīng)用于食品和藥品具有巨大的潛能,但是由于這些生物分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而導(dǎo)致其大量制備十分困難。目前寡糖的合成方法包括化學(xué)法及酶法合成。由于糖分子中多個(gè)可以參與反應(yīng)的羥基,化學(xué)法合成特定的糖苷鍵需要多步的保護(hù)及去保護(hù)操作,步驟繁瑣。而酶法合成糖苷鍵一步完成,可以在不對(duì)其它羥基進(jìn)行保護(hù)的情況下保證合成的區(qū)域選擇性和立體選擇性,步驟簡(jiǎn)單,而且可以在不對(duì)其它羥基進(jìn)行保護(hù)的情況下保證合成的區(qū)域選擇性和立體選擇性,因而在寡糖合成方面具有一定優(yōu)勢(shì)。一步法合成寡糖反應(yīng)中應(yīng)用的兩類(lèi)酶分別是糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases)和糖苷酶(glycosidases)。糖基轉(zhuǎn)移酶是生物體內(nèi)天然合成寡糖或者聚糖的酶,立體選擇性和區(qū)域選擇性好,反應(yīng)效率高,但是糖基轉(zhuǎn)移酶需要價(jià)格昂貴的活化的糖核苷酸作為糖基供體,不利于體外規(guī)�；铣煞磻�(yīng)。糖苷酶又稱(chēng)為糖苷水解酶,通常是天然條件下對(duì)聚糖或者糖綴合物上的糖苷鍵進(jìn)行水解的一類(lèi)酶,但是某些種類(lèi)的糖苷酶在體外條件下,也可以利用簡(jiǎn)單糖類(lèi)為糖基供體催化糖基化反應(yīng)(glycosylation)或者轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(transglycosylation)合成糖苷鍵,生成各類(lèi)糖類(lèi)化合物。由于糖苷酶催化糖苷鍵合成的糖基供體可以為單糖、寡糖及其他糖苷類(lèi)化合物,因此可以低成本、大規(guī)模的合成寡糖及其衍生物,因而該類(lèi)酶的合成能力受到廣泛關(guān)注。α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是一類(lèi)重要的糖苷酶,該酶天然情況下可以水解除去多種寡糖或者糖綴合物末端的半乳糖基。根據(jù)氨基酸序列相似性,α-半乳糖苷酶歸屬于糖苷酶家族GH4、GH27、GH36、GH57、GH97和GH110(http://www.cazy.org/)。已有具有轉(zhuǎn)糖基活性的α-半乳糖苷酶應(yīng)用于半乳寡糖和糖苷的合成報(bào)道,大部分已知的轉(zhuǎn)糖基α-半乳糖苷酶能夠催化合成Galα1-3或者Galα1-6糖苷鍵,只有極少數(shù)α-半乳糖苷酶能夠催化合成Galα1-4糖苷鍵,包括水蘇屬(Stachys affinis)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) 100-16/100-23來(lái)源的α-半乳糖苷酶以及本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的來(lái)源于短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)203的α-半乳糖苷酶。目前僅有短雙歧桿菌的酶能以甲基乳糖苷為受體催化合成globotriose衍生物,但區(qū)域選擇性不嚴(yán)格,合成兩種異構(gòu)產(chǎn)物。因而篩選新的具有轉(zhuǎn)糖基活性、區(qū)域選擇性專(zhuān)一的α-半乳糖苷酶對(duì)于藥用寡糖及糖綴合物的合成具有重要意義。本論文首先進(jìn)行了具有轉(zhuǎn)糖基活性的α-半乳糖苷酶的篩選,目標(biāo)是以乳糖為糖基受體篩選獲得能夠合成Galal-4糖苷鍵的糖苷酶。通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)克隆了不同微生物來(lái)源的9個(gè)α-半乳糖苷酶基因,即干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) JCM1134 α-半乳糖苷酶基因agaLc (2295 bp),短乳桿菌(Lactobacillus breve) JCM1059 α-半乳糖苷酶基因agaLb737 (2214 bp),產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC13124 α-半乳糖苷酶CPF 0491基因(2205bp),以及脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis) NCTC 9343來(lái)源的α-半乳糖苷酶BF1418、BF4189、BF0233、BF0498、BF0803、BF0227基因(大小分別為1503bp、1491 bp、2160 bp、2169 bp、2076 bp、1593 bp)。將這些α-半乳糖昔酶基因與pBAD/His A載體連接轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli LMG194,構(gòu)建基因工程菌用于重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)。9個(gè)重組α-半乳糖苷酶均可以表達(dá)出可溶性蛋白,重組酶粗酶液均表現(xiàn)出對(duì)對(duì)硝基半乳糖苷(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside,pNPαGal)的水解活性。用重組酶粗酶液催化以pNPaGal為供體、乳糖為受體的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)研究結(jié)果說(shuō)明,除BF0803外,其余8個(gè)重組酶均可以催化合成以乳糖為受體的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。其中CPF 0491、BF0233和BF0227合成的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物經(jīng)TLC檢測(cè)與globotriose標(biāo)準(zhǔn)品遷移率一致,轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)高效陰離子交換色譜(HPAEC)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)只有BF0227的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物與globotriose標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致。對(duì)轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進(jìn)行乙�；揎�,NMR分析結(jié)構(gòu)表明該產(chǎn)物為半乳糖以α1-4糖苷鍵與乳糖連接的寡糖,這是首例可以以天然乳糖為受體催化合成Galα1-4糖苷鍵的α-半乳糖苷酶,因此后續(xù)的研究工作均圍繞BF0227開(kāi)展。進(jìn)一步研究表明,由于重組酶BF0227在已經(jīng)構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中無(wú)法實(shí)現(xiàn)Ni-親和層析純化。該酶基因大小為1593 bp,編碼約58.3KDa的蛋白,屬于GH27家族,根據(jù)SignalP4.1分析,其N(xiāo)-端的24個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)的理論信號(hào)肽序列。進(jìn)而克隆BF0227基因去除的N-端信號(hào)肽編碼的核苷酸序列,命名為agaBf3S,構(gòu)建基因工程菌E. coli LMG194/pBAD/His A-agaBf3S,對(duì)重組酶AgaBf3S進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)過(guò)Ni-親和層析純化得到AgaBf3S純酶,分子量約59.2kDa。對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,在進(jìn)行水解反應(yīng)時(shí),AgaBf3S最適pH 4.5,在pH4.0-11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,最適溫度40℃,溫度高于40℃時(shí)迅速失活。重組酶AgaBf3S受各種離子的影響較小,為非離子依賴(lài)的酸性中溫糖苷酶。AgaBf3S可高效水解pNPαGal,當(dāng)以oNPαGal底物時(shí),其水解活力為pNPαGal水解活力的37.58%,對(duì)其它底物如mNPaGal、β-糖苷鍵連接底物或非半乳糖硝基苯糖苷均沒(méi)有水解活性。對(duì)AgaBf3S水解人工及天然底物的Km和kcat分別進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果表明,AgaBf3S水解pNPαGal、蜜二糖和globotriose的Km和kcat值分別為1.27mM和172.97 S-1,62.76 mM和7.74 S-1,4.62 mM和388.45 S-1; AgaBf3S水解pNPaGαl、蜜二糖和globotriose的kcat/Km值分別為135.88 mM-1S-1,0.28 mM-1S-1, 84.12mM-1S-1。以上三種底物中,AgaBf3S對(duì)pNPαGal的親和力和水解效率均最高,說(shuō)明pNPαGal較合適作為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)供體。將AgaBf3S以pNPaGal為供體、以乳糖為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng),并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,研究了底物濃度、pH、溫度等對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響,確定產(chǎn)物產(chǎn)率最高的反應(yīng)條件為：起始乳糖濃度500 mM、pNPαGal濃度20 mM、酶濃度0.6 U/mL,在100 mM pH 4.5NaAc緩沖液中40℃反應(yīng)30 min,此時(shí)產(chǎn)物(命名為PLac)產(chǎn)率為32.4%。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,并將其1H NMR譜及1H,13C-HSQC譜與globotriose的標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)譜圖進(jìn)行比較,結(jié)合TLC遷移率、質(zhì)譜結(jié)果、HPAEC保留時(shí)間分析,確定該轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物為globotriose。該結(jié)果顯示AgaBf3S是一步法合成globotriose的新型工具酶。進(jìn)一步研究了該酶的轉(zhuǎn)糖基受體選擇性,以多種二糖、單糖和糖醇為受體建立轉(zhuǎn)糖基反應(yīng),結(jié)果表明AgaBf3S可以在纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖等二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖等醛糖為受體時(shí)合成轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物,并且受體非還原端為半乳糖時(shí)產(chǎn)物產(chǎn)量較高,在以山梨糖、果糖等酮糖,甘露醇、山梨醇等糖醇以及木糖和鼠李糖為受體時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成,說(shuō)明糖基受體糖環(huán)結(jié)構(gòu)、羥基位置,尤其是C-4上羥基的鍵型對(duì)于AgaBf3S的受體選擇性具有十分重要的影響。進(jìn)一步通過(guò)隨機(jī)突變與定點(diǎn)突變相結(jié)合的方式獲得了轉(zhuǎn)糖基效率提高的突變酶,同時(shí)對(duì)AgaBf3S受體選擇性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了研究。α-半乳糖苷酶催化合成反應(yīng)時(shí)遵循糖苷酶的一般作用機(jī)制,在反應(yīng)后期還會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進(jìn)行二次水解,因此產(chǎn)物產(chǎn)量不高。為了提高AgaBf3S催化合成globotriose的產(chǎn)率,對(duì)AgaBf3S進(jìn)行了隨機(jī)突變研究,確定了2個(gè)對(duì)轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率有較大影響的氨基酸位點(diǎn),并對(duì)這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了不同類(lèi)型的氨基酸替換,最終得到了突變酶A141W和H426S,其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物產(chǎn)率分別為36.06%和38.25%,與原始酶(產(chǎn)率為32.4%)相比,產(chǎn)率分別提高了11%和18%。通過(guò)對(duì)AgaBf3S進(jìn)行同源模建(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index,模板為鏈霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)來(lái)源的β-L-阿拉伯糖苷酶Arap27A),根據(jù)其三維模擬結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),A141位于催化腔的腔口,可能是由于該位點(diǎn)的丙氨酸突變成了非極性的色氨酸后導(dǎo)致反應(yīng)腔內(nèi)水活度降低,轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物可以大量積累。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì),推測(cè)出多個(gè)與AgaBf3S催化活性相關(guān)的重要氨基酸位點(diǎn),其中D135為親核位點(diǎn),D191為酸堿催化位點(diǎn),D48、K133、C170、R187為底物結(jié)合位點(diǎn),Y101、W172、P194為推測(cè)的配體結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)氨基酸定點(diǎn)突變進(jìn)一步確定了W172為受體結(jié)合相關(guān)位點(diǎn),該位點(diǎn)的色氨酸突變?yōu)楸奖彼岷?可以以pNPαGal為受體合成大量自轉(zhuǎn)產(chǎn)物,而原始酶不以pNPαGal為受體合成自轉(zhuǎn)產(chǎn)物,說(shuō)明該位點(diǎn)氨基酸的替換改變了酶的受體選擇性。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q55
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本文編號(hào)：2383175