【摘要】：降解微生物固定化處理能夠有效解決游離降解微生物在環(huán)境修復(fù)中適應(yīng)性差的問題,是污染環(huán)境生物修復(fù)的必要手段之一。傳統(tǒng)的微生物固定化方法均不同程度地存在缺點(diǎn),極大地限制了生物修復(fù)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。因此,開發(fā)保護(hù)作用充分,且傳質(zhì)性能優(yōu)良的微生物固定化技術(shù),可為生物修復(fù)技術(shù)在環(huán)境修復(fù)中實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)支持。本文以聚陽離子電解質(zhì)殼聚糖(chitosan,CHI)和聚陰離子電解質(zhì)海藻酸鈉(alginate,ALG)為固定化材料,制備出層層自組裝(layer by layer assembly,LBL)微囊,將一株芘降解菌微黃分支桿菌CP13封裝于微囊中。在對比微囊法與傳統(tǒng)固定化法對土壤中芘的修復(fù)效果和基礎(chǔ)上,全面考察了微囊固定化CP13對不同芘初始濃度、pH、溫度、鹽度四種環(huán)境因素的適應(yīng)性以及降解過程中土壤微生物群落演替規(guī)律,明確了微囊固定化促進(jìn)CP13對芘修復(fù)效果的機(jī)制以及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),研究了CP13的胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)與微囊材料之間的相互作用,探討微囊提升CP13的環(huán)境適應(yīng)性及降解性能的機(jī)制。論文主要結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)如下:1.利用LBL自組裝原理,以CaCO_3為模板,應(yīng)用CHI和ALG制備出一種LBL微囊。通過微觀形貌表征,發(fā)現(xiàn):微囊整體形狀為片狀,高200-400 nm,長3-4μm,微觀呈多孔結(jié)構(gòu),大部分為介孔。生物培養(yǎng)降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與游離菌相比,LBL微囊固定化降解菌對環(huán)境因子表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,可適應(yīng)更高的污染濃度、更寬泛的溫度和酸度范圍及更高的鹽脅迫環(huán)境。這可能是由于封裝微生物的囊壁聚電解質(zhì)材料處在外界環(huán)境與細(xì)菌之間,為降解菌起到壁壘的作用,有利于維持細(xì)菌內(nèi)部的pH值恒定,避免細(xì)菌的酸化。同時(shí),LBL微囊具有較高的的孔隙率,能有效保證氧氣和底物的輸送以及產(chǎn)物的自由擴(kuò)散,避免累積,有利于降解菌的存活、生長、繁殖和代謝。2.將LBL微囊固定化微生物用于芘污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:固定化菌劑對芘的去除率、酶活及芘降解菌數(shù)量均高于游離菌,能顯著提高污染土壤的微生物多樣性,有利于改善土壤生態(tài)質(zhì)量。LBL微囊處理土壤中的優(yōu)勢門類主要為Proteobacteria和Actinobacteria,優(yōu)勢菌屬則包括Xanthomonadaceae、Planococcaceae、Pseudomonas、Mycobacterium、Sphingomonadaceae、Acinetobacter、Flavobacterium、Comamonadaceae、Bacillus、Sphingobacterium、Enterobacteriaceae及Streptomyces。其中,檢測到的Pseudomonas、Bacillus、Sphingobacterium和Comamonadaceae是廣泛報(bào)道的多環(huán)芳烴降解菌,而Enterobacteriaceae和Streptomyces鮮有報(bào)道具有降解多環(huán)芳烴的能力。在LBL微囊處理中還發(fā)現(xiàn)一些著名的photosynthesis類細(xì)菌,如綠彎菌Chloroflexus,該類細(xì)菌能夠在降解過程中產(chǎn)生O_2,有利于提高土壤氧含量,促進(jìn)微生物對污染物的代謝。LBL微囊固定化菌劑處理土壤的細(xì)菌多樣性提高,進(jìn)一步證實(shí)該處理土壤中污染物的大量去除。芘降解效率及修復(fù)效果的提高與多環(huán)芳烴降解微生物種類及土壤微生物多樣性增加之間存在正相關(guān)性。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),分別考察了游離態(tài)CP13及LBL微囊固定化CP13在降解芘過程中的細(xì)胞生理特性,結(jié)果顯示:降解過程中,過量芘及其中間產(chǎn)物會持續(xù)對游離CP13的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞,使細(xì)胞膜通透性增大,膜電位降低,甚至可使細(xì)胞膜破裂,膜完整性受到嚴(yán)重破壞,最終造成降解菌的死亡。LBL微囊固定化處理可有效減緩細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞及膜電位的降低速度和幅度,顯著降低細(xì)胞的死亡速度及死亡數(shù)量,對降解菌的細(xì)胞膜具有明顯的保護(hù)作用。4.借助三維熒光光譜、圓二色光譜、紅外光譜及激光光散射分析等多種分析手段,研究了細(xì)菌CP13的胞外聚合物EPS與LBL微囊材料的相互作用,結(jié)果表明:LBL微囊中的CHI與微生物的EPS蛋白質(zhì)組分之間具有結(jié)合能力,兩者結(jié)合生成穩(wěn)定的基態(tài)物質(zhì),引起靜態(tài)熒光淬滅,兩者相互作用產(chǎn)生的CHI-EPS復(fù)合物表現(xiàn)出比原始EPS大幅增大的平均分子量,也擴(kuò)張了原始EPS的Z-軸均方旋轉(zhuǎn)半徑和水力學(xué)半徑,降低了EPS的內(nèi)部密度,使得EPS結(jié)構(gòu)舒展,構(gòu)型變得疏松,從而提升微生物胞外傳質(zhì)性能和對污染物的俘獲效率,最終促進(jìn)微生物對芘的降解。本課題開發(fā)出的LBL自組裝微囊固定化降解菌技術(shù),可為微生物修復(fù)技術(shù)在環(huán)境修復(fù)中的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X172

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本文編號：2345478