【摘要】：豬在機(jī)體大小、器官解剖結(jié)構(gòu)、遺傳和免疫學(xué)等方面與人類非常接近,同時豬又是全世界廣泛飼養(yǎng)的肉用家畜,倫理限制相對較少,故豬被認(rèn)為是最具潛力的生物醫(yī)學(xué)模型動物,但因豬沒有真正的胚胎干細(xì)胞而限制了豬在這些領(lǐng)域的應(yīng)用。在過去的二十多年中,研究人員在人和嚙齒類動物胚胎干細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上對豬多能干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)進(jìn)行了廣泛地探索。豬胚胎來源的多能干細(xì)胞系的研究始于20世紀(jì)90年代初,Evans等和Strojek等將豬植入前胚胎作為原代材料,在已有的小鼠胚胎干細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上探討了豬胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中涉及的飼養(yǎng)層細(xì)胞類型、胚胎胚齡、全胚或分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對原代克隆生成的影響,并初步描述了豬類胚胎干細(xì)胞的特征。此后研究人員針對豬胚胎干細(xì)胞建系的各種影響因素進(jìn)行了更為全面的研究,主要包括建系所用胚胎的胚齡、飼養(yǎng)層細(xì)胞的種類、胚胎接種方式、胚胎來源和培養(yǎng)體系等,但目前仍然面臨幾個以下問題:(1)獲得的細(xì)胞系均為豬胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞系;(2)各細(xì)胞系的多能性鑒定指標(biāo)參差不齊;(3)無有效的培養(yǎng)體系,建系效率低;(4)細(xì)胞系體內(nèi)和體外分化能力弱,很難形成畸胎瘤;(5)獲得的細(xì)胞系很難進(jìn)行基因編輯操作,攜帶的外源基因不能穩(wěn)定表達(dá);(6)不能獲得生殖系嵌合動物。本研究針對這些問題進(jìn)行了以下四部分的探索:(1)探索氧氣濃度、培養(yǎng)液和胚胎胚齡對豬胚胎干細(xì)胞建系所產(chǎn)生的影響;(2)探索豬多能干細(xì)胞的多能性特征及其體內(nèi)和體外分化能力;(3)探索豬胚胎來源的干細(xì)胞是否可用于基因編輯操作;(4)探索豬胚胎來源的干細(xì)胞獲得克隆動物和嵌合動物的可行性。經(jīng)過對上述內(nèi)容的研究,結(jié)果顯示:(1)我們能夠在新研發(fā)的MXV培養(yǎng)液和5%氧氣濃度的培養(yǎng)體系下從5.5天的豬體外受精囊胚中分離培養(yǎng)獲得豬多能干細(xì)胞系(porcine PluripotentStemCells,pPSCs)。pPSCs已在體外培養(yǎng)超過75代,其克隆形態(tài)和人胚胎干細(xì)胞相似。對pPSCs的鑒定結(jié)果表明,pPSCs呈堿性磷酸酶陽性,具有正常核型,表達(dá)經(jīng)典的多能性標(biāo)記OCT4、SOX2和NANGO。擬胚體自發(fā)分化的結(jié)果和畸胎瘤的結(jié)果均證明pPSCs具有體外和體內(nèi)分化能力。攜帶外源基因fuw-Dsred的pPSCs細(xì)胞系(pPSC-FDs)能夠在穩(wěn)定傳代的同時表達(dá)DsRed和多能性標(biāo)記。把pPSC-FDs作為供體細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植后,11.52%的重構(gòu)胚胎可以在體外培養(yǎng)至囊胚期。將pPSC-FDs注射到4.5天的小腔囊胚中,pPSC-FDs細(xì)胞能夠參與到體外胚胎的發(fā)育中,將嵌合胚胎移入到受體母豬中時,pPSC-FDs細(xì)胞能夠嵌合到妊娠50天胎兒的內(nèi)臟組織和胎盤組織中。(2)MXV培養(yǎng)液成分極其復(fù)雜,該培養(yǎng)環(huán)境不利于對pPSCs多能性維持機(jī)制的進(jìn)一步研究,因此,我們對MXV進(jìn)行優(yōu)化后獲得了一個新的成分明確的無血清培養(yǎng)基(KO培養(yǎng)基)。在KO培養(yǎng)體系中,我們可以從豬5.5天的體外受精胚胎中分離培養(yǎng)獲得豬多能干細(xì)胞系pPSC-KOs,該細(xì)胞系多能性正常,在體外可自發(fā)分化為三胚層細(xì)胞系,可向神經(jīng)方向和成骨方向定向誘導(dǎo)分化,能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作,可嵌合到體外發(fā)育的胚胎中。綜上,這些結(jié)果顯示我們獲得的兩個豬多能干細(xì)胞系(pPSCs和pPSC-KOs)將會成為豬遺傳工程和闡釋豬特異性多能性調(diào)控分子機(jī)制的有效細(xì)胞系。通過對上述研究內(nèi)容的總結(jié),具體結(jié)論有:(1)通過優(yōu)化影響豬胚胎干細(xì)胞建系的因素(氧氣濃度,培養(yǎng)液和胚胎胚齡),我們培養(yǎng)獲得了可持續(xù)傳代的pPSCs,pPSCs具有與人和小鼠胚胎干細(xì)胞類似的多能性。(2)獲得的pPSCs具有良好的體外和體內(nèi)分化能力,能夠穩(wěn)定攜帶外源基因;將pPSCs作為供體細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆胚胎時,重構(gòu)胚胎可以在體外培養(yǎng)至囊胚期;將pPSCs用于囊胚嵌合時,pPSCs具有胎盤和內(nèi)臟嵌合能力。(3)通過對MXV培養(yǎng)液的成分逐一撤除,我們最終得到了成分明確的無血清培養(yǎng)基(KO),該培養(yǎng)體系下建立的pPSC-KOs細(xì)胞系的多能性與小鼠胚胎干細(xì)胞的多能性更相近。(4)獲得的pPSC-KOs具有良好的體外自發(fā)分化和定向誘導(dǎo)分化能力,能夠穩(wěn)定攜帶外源基因,用作核移植供體細(xì)胞后重構(gòu)胚胎能夠發(fā)育至囊胚期,能夠嵌合到體外培養(yǎng)的胚胎中。(5)不同培養(yǎng)體系下(MXV和KO)培養(yǎng)獲得的豬多能性干細(xì)胞(pPSCs和pPSC-KOs)主要依賴的信號通路具有差異性,pPSCs同時依賴FGF和LIF兩條信號通路,而pPSC-KOs則更傾向于依賴LIF信號通路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：2326347