【摘要】：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是重要的工業(yè)菌株,作為發(fā)酵劑與保加利亞乳桿菌或瑞士乳桿菌一起應用于酸奶或奶酪的生產(chǎn),賦予產(chǎn)品特殊的風味、質(zhì)地和保質(zhì)期。發(fā)酵劑菌株的活力直接影響發(fā)酵乳的品質(zhì),但是容易受到酸、溫度、氧、滲透壓等因素的影響。因此,闡明菌株抗性機制,提高其抗脅迫能力,是制備高活性發(fā)酵劑的關鍵。嗜熱鏈球菌屬于兼性厭氧菌,在所有脅迫中,氧脅迫對其造成的傷害最為嚴重。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌具有一定的抵抗活性氧的能力,可以在有氧條件下生長和在低H2O2濃度下存活,但是該菌株缺少過氧化氫酶,其抵抗過氧化氫脅迫的機制一直未被闡明。本文主要圍繞S. thermophilus CGMCC7.179過氧化物酶的鑒定和作用展開研究。首先對已測序的S. thermophilus CGMCC7.179進行基因組序列分析,鑒定出了染料過氧化物酶及其相關基因,并檢測了這些基因是否具有抵抗氧脅迫的能力,進一步研究了染料過氧化物酶消除過氧化氫的能力和作用方式；研究了染料過氧化物酶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能,并探討了該系統(tǒng)在其它乳酸菌中的可利用性。取得的具體實驗結(jié)果如下：1. S. thermophilus CGMCC7.179染料過氧化物酶efeB基因的遺傳組成和抗氧脅迫能力嗜熱鏈球菌具有超氧化物歧化酶,其催化產(chǎn)生的H2O2會對細胞造成傷害。然而,嗜熱鏈球菌中H2O2的消除機制尚不清晰。本文在S. thermophilus CGMCC7.179的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個染料過氧化物酶家族的基因efeB,其編碼蛋白的氨基端攜帶一個具有雙精氨酸易位(twin-arginine translocation, Tat)保守基序的信號肽,而且此基因與Tat系統(tǒng)的結(jié)構元件基因tatA和tatC一起位于efeOBU-tatCA操縱子中。敲除fefB基因不影響S. thermophilus CGMCC7.179在靜置條件下的生長,但是會導致S.thermophilus CGMCC7.179在搖動培養(yǎng)時的生物量和活菌數(shù)顯著下降,說明EfeB具有抵抗氧脅迫的能力。tatC基因的敲除對S. thermophilus CGMCC7.179的影響類似于efeB基因,而且,只有在tatC基因存在時,回補efeB基因才能夠彌補S. thermophilusCGMCC7.179 efe B缺失株在搖動培養(yǎng)時的生物量下降。說明EfeB抗氧脅迫能力的實現(xiàn)需要Tat系統(tǒng)的協(xié)助。同時,S. thermophilus CGMCC7.179中的氯霉素抗性實驗和Escherichia coli DE3中的亞細胞定位實驗進一步證實了TatCA對EfeB的轉(zhuǎn)運功能。此外,RT-PCR實驗證實,在搖動培養(yǎng)條件下,efeB和tatC基因的轉(zhuǎn)錄水平均得到了相似的上調(diào),進一步表明這兩個基因?qū)儆谝粋�操縱子。以上結(jié)果表明S. thermophilus CGMCC7.179編碼的EfeB經(jīng)Tat系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞外,以緩解細胞受到的氧化壓力的傷害。2.5. thermophilus CGMCC7.179 EfeB的功能研究血紅素過氧化物酶可以催化特定的電子供體還原過氧化氫為水,根據(jù)其作用和結(jié)構特征,血紅素過氧化物酶可以分為動物過氧化物酶、植物過氧化物酶家族和新劃分出的染料過氧化物酶家族。本文為了確定EfeB的功能,首先將其序列與多種染料過氧化物酶的序列進行了比對,發(fā)現(xiàn)EfeB具有染料過氧化物酶的保守結(jié)構域G-X-X-D-G和heme結(jié)合位點,并且與肉葡萄球菌編碼的染料過氧化物酶FepB的相似性高達48.13%,表明EfeB具有染料過氧化物酶的結(jié)構特征。為了研究EfeB的酶學性質(zhì),我們在大腸桿菌中表達純化了EfeB蛋白,該蛋白在200μM H2O2條件下可以使活性藍5褪色,表明EfeB具有過氧化物酶酶活,此反應的最適pH和最適溫度分別為4.0和30℃,與嗜熱鏈球菌的生長環(huán)境并不相符。為了檢測EfeB消除H202的能力,我們測定了S. thermophilus CGMCC7.179及其efeB缺失株的搖動培養(yǎng)物中的H202濃度,結(jié)果顯示fefB缺失會導致培養(yǎng)環(huán)境中H202濃度的升高,表明EfeB具有消除生存環(huán)境中H2O2的能力。此外,實驗發(fā)現(xiàn)S. thermophilus CGMCC7.179的efeB缺失株能夠利用三價鐵離子,但是缺少利用二價鐵離子的能力,而且對高濃度二價鐵離子的耐受能力降低,表明EfeB可以氧化二價鐵離子。由此可見,S. thermophilus CGMCC7.179中的EfeB具有消除H2O2的作用,同時與二價鐵離子的攝取有關,與efeOBU的基因結(jié)構相吻合。3. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系統(tǒng)組分的功能研究Tat系統(tǒng)負責轉(zhuǎn)運折疊后的蛋白,在轉(zhuǎn)運含輔基或多亞基蛋白方面具有優(yōu)勢,但是這一系統(tǒng)在乳酸菌中非常罕見。我們在S. thermophilus CGMCC7.179中發(fā)現(xiàn)了Tat系統(tǒng)的TatA和TatC組分,但是它們的功能鮮為人知。本文中我們將tatA基因和tatC基因回補到E. coli DE3的tat缺失菌株中,構建了回補菌株E. coli ArA, ArAB, CrC和 ACrAD用以檢測TatA和TatC組分的功能。E.coli DE3的tat缺失菌株對十二烷基磺酸鈉(SDS)敏感,而且細胞表現(xiàn)為鏈狀。在回補菌株中,E coli ArAB和CrC既表現(xiàn)出相對正常的細胞形態(tài),也能夠抵抗較高濃度的SDS。然而,E. coli ACrAD只有相對正常的細胞形態(tài),對SDS仍然極為敏感。與之相反,E. coli ArA能夠耐受SDS,卻表現(xiàn)出極為嚴重的細胞鏈化現(xiàn)象。這些結(jié)果表明,TatA和TatC在E. coli DE3的tat缺失菌株中都具有易位酶活性,可以幫助E coli DE3缺失株緩解細胞鏈化或者重建SDS抗性。而且TatA是一個雙功能組分,可以同時彌補TatAE和TatBE(下標“E”表示此組分屬于大腸桿菌)；另一方面,TatA的作用效果會受到TatBE的影響。因此,S.. thermophilus CGMCC 7.179的TatA和TatC都具有Tat組分的典型功能,它們可以在大腸桿菌中組成一個最小化的Tat系統(tǒng)。根據(jù)上述實驗結(jié)果,可以推測出S.. thermophilus CGMCC7.179 efeOBU-tatCA操縱子的作用方式。TatC和TatA形成通道,將EfeB轉(zhuǎn)運至胞外；EfeB在胞外具有雙功能,一方面可以以蒽醌類物質(zhì)為電子供體消除環(huán)境中的過氧化氫,另一方面將二價鐵離子氧化為三價鐵離子,再由EfeOU復合體攝取到胞內(nèi)。4. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系統(tǒng)在乳酸乳球菌中的利用乳酸菌作為食品級安全菌株,是優(yōu)秀的食品級重組蛋白生產(chǎn)菌株。為了提高重組蛋白的產(chǎn)量,研究者們正不斷豐富其表達和分泌系統(tǒng)。目前乳酸菌中使用的分泌系統(tǒng)以Sec系統(tǒng)為主,大多數(shù)乳酸菌不具有可以分泌折疊蛋白的Tat系統(tǒng)。本文從蛋白功能和蛋白亞細胞定位兩個方面探究S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系統(tǒng)在Lactococcus lactis MG1363中的功能。由于Lc.lactis MG1363的抗氧化能力強于S.thermophilus CGMCC7.179,不受搖動培養(yǎng)的影響,我們使用H2O2來檢測菌株的抗氧化能力。弱啟動子驅(qū)動下低量串聯(lián)表達的EfeB和TatCA不能提高Lc. lactis MG1363的抗H202能力；強啟動子驅(qū)動下高量串聯(lián)表達EfeB和TatCA可以解除單獨高量表達EfeB造成的生長速度減緩,而且增強了Lc. lactis MG1363的抗H202能力,表明TatCA可以轉(zhuǎn)運EfeB,并發(fā)揮抗氧脅迫能力。為了直觀展示Lc. lactis MG1363中TatCA對底物蛋白的轉(zhuǎn)運,我們分別將金黃色葡萄球菌核酸酶基因nuc和綠色熒光蛋白基因gfp與EfeB的信號肽序列sp融合后作為報告基因,與tatCA一起轉(zhuǎn)化到Lc. lactis MG1363中。結(jié)果表明,TatCA可以轉(zhuǎn)運spNuc蛋白至胞外,但是轉(zhuǎn)運spGFP的能力非常有限。所有結(jié)果表明,S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系統(tǒng)在Lc.lactis MG1363中可以發(fā)揮作用,但是對于不同的底物蛋白有不同的效果。5. Lactobacillus fermentum 1001木糖利用脫阻遏機制研究發(fā)酵乳桿菌是一種生存環(huán)境較為復雜的乳酸菌,可以同時利用葡萄糖和木糖,缺失碳源代謝物抑制(CCR)。為了研究這一現(xiàn)象的原因,本文首先驗證了Lact.fermentum 1001 CcpAf的生理功能。RT-PCR結(jié)果表明Lact.fermentum 1001中ccpAf基因的可以正常轉(zhuǎn)錄；Lc.lactis MG1363 ccpA缺失菌株的生長會明顯滯后于野生菌株,回補ccpAf基因可以有效提高Lc. lacrtis MG1363 ccpA缺失菌株的生長速度,此結(jié)果證明CcpAf具有正常的生理功能。為了探究是否是1,6-二磷酸果糖的缺失造成了Lact.fermentum 1001中CCR的缺失,我們在Lact. fermentum 1001中表達了Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842的磷酸果糖激酶,重組菌的果糖的利用會受到葡萄糖的松散抑制,但是木糖的利用不受影響,表明CcpAf在 Lact. fermentum 1001中可以正常發(fā)揮作用,1,6-二磷酸果糖的缺失是Lact. fermentum 1001中CCR缺失的一個原因。此外,Lact. fermentum 1001木糖操縱啟動子(Plx)的活性在具有CCR的Lact.casei BL23中也未受到葡萄糖的抑制,而果糖操縱子的活性受到了松散抑制,表明啟動子區(qū)域代謝物響應元件(cre)的缺失也會影響CCR�？傊�,Lact. fermentum1001的木糖利用脫阻遏是由缺少cre和磷酸果糖激酶造成的。Lact. fermentum 1001缺少CCR,可以同時利用多種碳源以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的。用Plx對乳酸菌進行代謝工程改造,可以提高它們利用復雜碳源時的發(fā)酵效率。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q936
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本文編號：2288953