【摘要】：氧是地球上大多數(shù)生物賴以生存的必需元素,低氧(Hypoxia)環(huán)境會(huì)造成生物體內(nèi)部組織或細(xì)胞缺氧,繼而引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生生理病理變化并影響生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。地下鼠長(zhǎng)期生活于氧氣含量較低的地下洞道系統(tǒng)中,在形態(tài)、生理、行為和遺傳等方面形成了良好的低氧適應(yīng)。棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)終生營(yíng)地下生活,是一種典型的地下鼠,其近緣種布氏田鼠(L.brandtii)則以地面活動(dòng)為主,二者是地下低氧環(huán)境適應(yīng)比較研究的理想對(duì)象。本論文以棕色田鼠為研究對(duì)象,以布氏田鼠為對(duì)照;通過(guò)對(duì)棕色田鼠野外環(huán)境參數(shù)的調(diào)查,獲得了不同季節(jié)洞道系統(tǒng)中O2/CO2含量、溫度、濕度等數(shù)據(jù);通過(guò)構(gòu)建基于線粒體基因組序列的進(jìn)化樹(shù),確定了棕色田鼠和布氏田鼠的分類地位與親緣關(guān)系;在低氧艙內(nèi)模擬慢性低氧和急性低氧狀態(tài),完成不同氧環(huán)境下棕色田鼠和布氏田鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序、de novo組裝和注釋;采用比較轉(zhuǎn)錄組方法,分析不同低氧處理對(duì)棕色田鼠和布氏田鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的影響;結(jié)合棕色田鼠的全基因組測(cè)序、de novo組裝和注釋結(jié)果,對(duì)棕色田鼠有參和無(wú)參轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)結(jié)果的一致性進(jìn)行了研究;最后,系統(tǒng)整理了棕色田鼠和布氏田鼠低氧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及棕色田鼠全基因組數(shù)據(jù),構(gòu)建具有存儲(chǔ)、管理、查詢和局域網(wǎng)遠(yuǎn)程訪問(wèn)功能的數(shù)據(jù)庫(kù),實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享和可視化操作。主要結(jié)果分述如下:1)棕色田鼠洞道長(zhǎng)約40 m,分支較少,取食與活動(dòng)洞道深度為20~30 cm,主巢和糧倉(cāng)深度為60~80 cm。洞道內(nèi)溫度恒定為24±2℃、濕度保持90%以上;正常洞道內(nèi)氧氣含量為17.24%~19.48%,雨后最低達(dá)到16.04%;洞道內(nèi)CO2含量在0.03%~2.55%之間,與氧氣濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.85,p0.001)。2)基于線粒體基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,棕色田鼠與布氏田鼠同隸屬于毛足田鼠屬(Lasiopodomys),該屬獨(dú)立成枝,與田鼠屬(Microtus)分枝有明顯區(qū)分,與狹顱田鼠(Microtus gregalis)和涼山田鼠(Proedromys liangshanensis)共同構(gòu)成單獨(dú)進(jìn)化枝。3)通過(guò)高通量測(cè)序,獲得棕色田鼠和布氏田鼠的18個(gè)腦組織樣品的135Gbp高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù);使用合并組裝法分別獲得了兩種鼠轉(zhuǎn)錄本的unigene集,N50長(zhǎng)度均大于2,200 bp,組裝效果較好;轉(zhuǎn)錄本注釋后分別得到棕色田鼠的20,172和布氏田鼠的19,215個(gè)注釋結(jié)果,其中,棕色田鼠Nr注釋結(jié)果中有2%的基因與同為地下鼠的盲鼴形鼠(Spalas galili)相似性較高。4)與常氧處理相比,10%慢性低氧處理48 h后,棕色田鼠有695個(gè)基因表現(xiàn)出差異表達(dá),布氏田鼠則僅為158個(gè);進(jìn)一步采用差異表達(dá)基因的功能注釋、代謝通路富集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析等方法研究,結(jié)果顯示,棕色田鼠上調(diào)了氧氣運(yùn)輸、血管生成、抑制血管生成、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等功能的調(diào)控基因,腦神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)、CO2防護(hù)、血壓和神經(jīng)興奮性升高等功能也有相應(yīng)上調(diào),此外,下調(diào)了蛋白水解、輔酶代謝等耗氧功能調(diào)控基因;布氏田鼠氧氣運(yùn)輸、血管生成和抑制、腦神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)及CO2防護(hù)等功能的調(diào)節(jié)基因有所上調(diào),神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺合成及傳遞相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。比較兩物種慢性低氧應(yīng)答發(fā)現(xiàn),布氏田鼠細(xì)胞水平的應(yīng)答較少,暗示棕色田鼠對(duì)慢性低氧的敏感性和應(yīng)答強(qiáng)度均較高。5)與常氧處理相比,5%急性低氧處理6 h后,棕色田鼠有1,386個(gè)基因表現(xiàn)出差異表達(dá),布氏田鼠則高達(dá)1,878個(gè);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),二者差異基因的功能注釋、代謝通路富集結(jié)果較為接近,均在血管生成、無(wú)氧呼吸激活、DNA修復(fù)和細(xì)胞增殖與凋亡等方面有大量功能基因表達(dá)上調(diào)。不同的是,棕色田鼠急性低氧下神經(jīng)細(xì)胞生成與保護(hù)和多個(gè)抑制血管生成相關(guān)基因上調(diào)、多巴胺合成與運(yùn)輸相關(guān)基因下調(diào),且有多個(gè)癌癥相關(guān)基因和抑癌基因表現(xiàn)出與腫瘤微環(huán)境相反的表達(dá)模式;布氏田鼠的主要上調(diào)功能集中于血管生成和免疫應(yīng)答,調(diào)控功能較為單一,神經(jīng)細(xì)胞生成與保護(hù)相關(guān)基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),暗示棕色田鼠的急性低氧應(yīng)答策略可能更為高效。6)棕色田鼠全基因組測(cè)序獲得140X基因組覆蓋度的高質(zhì)量數(shù)據(jù),組裝后得到總長(zhǎng)為2.10Gbp的Contigs,N50為51.15kbp,補(bǔ)洞后得到代表基因組全長(zhǎng)的Scaffolds共2.15Gbp,N50達(dá)到6.15Mbp;reads回比分析獲得777萬(wàn)余個(gè)SNP位點(diǎn);同源比對(duì)和從頭預(yù)測(cè)共獲得33.93%的重復(fù)序列、21,229個(gè)編碼基因和7,000余個(gè)非編碼RNA序列,共有19,801個(gè)編碼基因得到注釋;基于棕色田鼠全基因組的有參/無(wú)參轉(zhuǎn)錄組結(jié)果呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.836,p0.0001)。7)使用Access軟件將棕色田鼠和布氏田鼠的轉(zhuǎn)錄本拼接和注釋結(jié)果歸類整理為本地化數(shù)據(jù)庫(kù);通過(guò)BLAST+和Sequenceserver構(gòu)建兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組和棕色田鼠全基因組的本地BLAST比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù);最后使用過(guò)Java語(yǔ)言和Apache+Tomcat服務(wù)器實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)信息的局域網(wǎng)遠(yuǎn)程訪問(wèn)。結(jié)論:1)棕色田鼠洞道系統(tǒng)溫度穩(wěn)定,濕度較高,氧氣含量較低,二氧化碳含量較高,與Spalax屬物種的野外洞道環(huán)境參數(shù)相似;2)棕色田鼠與布氏田鼠均隸屬于毛足田鼠屬,與田鼠屬分枝區(qū)分明顯,與狹顱田鼠和涼山田鼠共同構(gòu)成單獨(dú)進(jìn)化枝;3)棕色田鼠和布氏田鼠的轉(zhuǎn)錄本unigene集各參數(shù)均比較相似,可能與二者親緣關(guān)系接近有關(guān);棕色田鼠Nr注釋結(jié)果中有2%與盲鼴形鼠相似性較高,推測(cè)與地下低氧環(huán)境適應(yīng)產(chǎn)生的趨同進(jìn)化有關(guān);4)與布氏田鼠相比,棕色田鼠對(duì)急性和慢性低氧均具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,分子機(jī)制主要包括高效的能量利用、嚴(yán)格的血管生成調(diào)控以及多層面的細(xì)胞修復(fù)與凋亡調(diào)節(jié);5)布氏田鼠具有一定的低氧適應(yīng)能力,主要表現(xiàn)在低氧時(shí)血管生成調(diào)控及氧氣運(yùn)輸能力的提升,但能量代謝和細(xì)胞增殖/凋亡水平的調(diào)控少于棕色田鼠,與地面動(dòng)物常見(jiàn)的低氧應(yīng)答機(jī)制類似;6)棕色田鼠全基因組測(cè)序得到高質(zhì)量的組裝和注釋結(jié)果,有參轉(zhuǎn)錄組分析與無(wú)參轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果擁有較高的一致性;7)構(gòu)建的棕色田鼠轉(zhuǎn)錄組和棕色田鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)的局域網(wǎng)訪問(wèn)及可視化查詢。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q953

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本文編號(hào)：2274514