本研究通過核黃素合成途徑的構(gòu)建,中心碳代謝的改造及發(fā)酵條件的優(yōu)化的策略,研究了大腸桿菌生產(chǎn)核黃素的代謝能力;其次,利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù),在大腸桿菌的基因組上整合β-胡蘿卜素合成基因,對MEP途徑、中心碳代謝途徑進(jìn)行組合改造,獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌。首先,考察大腸桿菌自身核黃素合成基因在不同拷貝數(shù)質(zhì)粒中表達(dá)對核黃素產(chǎn)量的影響,并與枯草芽孢桿菌核黃素合成基因比較。通過發(fā)酵驗證,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌自身核黃素合成基因在高拷貝質(zhì)粒過表達(dá)更有利于核黃素的積累。5-磷酸核酮糖是核黃素合成的重要前體物。為了提高5-磷酸核酮糖的供給,本文對氧化磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑以及ED途徑(Entner-Doudoroff Pathway)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)來源于谷氨酸棒桿菌的突變型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黃素產(chǎn)量;進(jìn)一步過表達(dá)大腸桿菌Qg源pgl基因能夠進(jìn)一步提高核黃素的產(chǎn)量;敲除糖酵解途徑中pgi基因構(gòu)建RF02S,使得核黃素的產(chǎn)量提高了72.4%,進(jìn)一步失活ED途徑使得核黃素的產(chǎn)量提高41.8%;過表達(dá)acs基因能夠有效的降低副產(chǎn)物乙酸的積累,對核黃素的產(chǎn)量沒有明顯的影響。最終獲得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖為底物的LB培養(yǎng)基中能夠積累585.2±13.6mg/L核黃素。為了防止過多的核黃素轉(zhuǎn)化為FMN和FAD,在不影響菌體生長的情況下提高核黃素的產(chǎn)量,通過對催化該反應(yīng)的酶基因ribF的RBS強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)。獲得工程菌RF05S-M40的核黃素激酶活性是出發(fā)菌株的64.8%,核黃素的產(chǎn)量達(dá)到1019.6±25.3mg/L�？疾霷F05S-M40在不同的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基對核黃素產(chǎn)量的影響。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基,RF05S-M40能夠積累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose,是迄今為止報道的核黃素得率最高工程菌株。本文第二部分利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù),將β-胡蘿卜素合成基因整合到基因組上,對MEP途徑進(jìn)行組合調(diào)控以增強(qiáng)IPP和DMAPP的合成,獲得工程菌ZF43能夠積累21.45±0.46mg/Lβ-胡蘿卜素。G3P和Pyr是MEP途徑的直接前體物,NADPH是β-胡蘿卜素合成的重要輔因子。為了提高這些代謝物的供給,對中心碳代謝、MEP途徑及β-胡蘿卜素合成途徑進(jìn)行組合優(yōu)化,獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌ZF237T,高密度發(fā)酵能夠獲得2.02g/Lβ-胡蘿卜素。首次在大腸桿菌中將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的應(yīng)用于代謝工程改造,并獲得高產(chǎn)菌種。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q936
文章目錄
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
1.1 引言
1.2 核黃素的概述
1.2.1 核黃素的理化性質(zhì)、功能、用途及市場需求
1.2.2 核黃素的合成
1.2.3 核黃素生物合成途徑及其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制
1.2.4 產(chǎn)核黃素菌株構(gòu)建的國內(nèi)外現(xiàn)狀
1.3 β-胡蘿卜素的概述
1.3.1 β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)、功能和用途
1.3.2 β-胡蘿卜素合成途徑
1.3.3 E.coli β-胡蘿卜素生物合成研究進(jìn)展
1.4 大腸桿菌基因組無痕重組技術(shù)及策略
1.4.1 λ-Red重組系統(tǒng)
1.4.2 歸巢核酸內(nèi)切酶
1.4.3 成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR)編輯系統(tǒng)
1.5 選題背景及研究內(nèi)容
1.5.1 大腸桿菌核黃素產(chǎn)核黃素菌株的構(gòu)建
1.5.2 大腸桿菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的構(gòu)建
第二章 核黃素操縱子的構(gòu)建和比較
2.1 實驗材料
2.1.1 菌株與質(zhì)粒
2.1.2 實驗儀器
2.1.3 實驗試劑
2.1.4 培養(yǎng)基
2.1.5 溶液
2.2 實驗方法
2.2.1 大腸桿菌CaCl_2轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
2.2.2 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化
2.2.3 基因組DNA的提取
2.2.4 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
2.2.5 DNA片段的PCR擴(kuò)增
2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳
2.2.7 DNA片段的回收和純化
2.2.8 DNA片段的酶切和連接
2.2.9 菌落PCR驗證
2.2.10 菌體培養(yǎng)與發(fā)酵
2.2.11 發(fā)酵液菌體濃度和葡萄糖的測定
2.2.12 發(fā)酵液中核黃素的測定
2.2.13 蛋白濃度測定
2.2.14 細(xì)胞粗酶液的制備
2.2.15 GTP環(huán)水解酶Ⅱ酶活力測定
2.2.16 核黃素合成酶酶活力測定
2.3 實驗結(jié)果與討論
2.3.1 大腸桿菌自身核黃素合成途徑的重構(gòu)
2.3.2 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的克隆
2.3.3 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的重構(gòu)
2.3.4 系列工程菌株核黃素產(chǎn)量表征
2.3.5 GTP環(huán)水解酶Ⅱ酶和核黃素合成酶活力測定
2.4 本章小結(jié)
第三章 產(chǎn)核黃素大腸桿菌中心碳代謝途徑的代謝工程改造
3.1 實驗材料
3.1.1 菌種和質(zhì)粒
3.1.2 實驗儀器
3.1.3 實驗試劑
3.1.4 培養(yǎng)基
3.1.5 溶液
3.2 實驗方法
3.2.1 Circular polymerase extension cloning
3.2.2 6-磷酸葡萄糖脫氫酶酶活力測定
3.2.3 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶酶活力測定
3.2.4 Real-Time熒光定量PCR
3.2.5 發(fā)酵液中有機(jī)酸的檢測
3.2.6 大腸桿菌基于λ-red和Ⅰ-SceⅠ的基因重組
3.3 實驗結(jié)果與討論
3.3.1 谷氨酸棒狀桿菌突變型zwf~(243)和gnd~(361)基因的過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
3.3.2 氧化磷酸戊糖途徑過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
3.3.3 pgi基因敲除菌株的構(gòu)建
3.3.4 ED途徑敲除菌株的構(gòu)建
3.3.5 acs基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建
3.3.6 氧化磷酸戊糖途徑的改造對核黃素產(chǎn)量的影響
3.3.7 pgi基因和ED途徑的敲除對核黃素產(chǎn)量的影響
3.3.8 acs基因的過表達(dá)對乙酸積累的影響
3.4 本章小結(jié)
第四章 ribF基因的改造及發(fā)酵條件的優(yōu)化
4.1 實驗材料
4.1.1 菌種和質(zhì)粒
4.1.2 實驗儀器
4.1.3 實驗試劑
4.1.4 培養(yǎng)基
4.1.5 溶液
4.2 實驗方法
4.2.1 核黃素激酶酶活力測定
4.3 實驗結(jié)果與討論
4.3.1 ribF基因的改造
4.3.2 置換ribF基因野生RBS片段的構(gòu)建
4.3.3 ribF基因野生RBS的置換
4.3.4 ribF基因的改造對核黃素產(chǎn)量的影響
4.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化
4.4 本章小結(jié)
第五章 基于MEP途徑的產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌構(gòu)建
5.1 實驗材料
5.1.1 菌種和質(zhì)粒
5.1.2 實驗儀器
5.1.3 實驗試劑
5.1.4 培養(yǎng)基
5.1.5 溶液
5.2 實驗方法
5.2.1 β-胡蘿卜素的檢測方法
5.2.2 β-胡蘿卜素的發(fā)酵實驗
5.2.3 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)λ-red重組
5.2.4 Golded Gate組裝方法
5.2.5 gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
5.3 實驗結(jié)果與討論
5.3.1 整合β-胡蘿卜素合成基因到大腸桿菌EcKan染色體上
5.3.2 MEP途徑調(diào)控元件的片段構(gòu)建
5.3.3 考察MEP途徑單基因調(diào)控對β-胡蘿卜素合成的影響
5.3.4 MEP途徑的組合優(yōu)化
5.4 本章小結(jié)
第六章 中心碳代謝及MEP途徑的組合優(yōu)化對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響
6.1 實驗材料
6.1.1 菌種和質(zhì)粒
6.1.2 實驗儀器
6.1.3 實驗試劑
6.1.4 培養(yǎng)基
6.1.5 溶液
6.2 實驗方法
6.2.1 高密度發(fā)酵重組大腸桿菌ZF237T
6.3 實驗結(jié)果與討論
6.3.1 中心碳代謝途徑操作片段的構(gòu)建
6.3.2 考察中心碳代謝單基因調(diào)控對β-胡蘿卜素合成的影響
6.3.3 中心碳代謝組合操作對β-胡蘿卜素合成的影響
6.3.4 β-胡蘿卜素合成途徑及MEP途徑的組合操作
6.3.5 中心碳代謝及MEP途徑的組合優(yōu)化
6.3.6 高密度發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素重組大腸桿菌ZF237T
6.4 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
7.1 結(jié)論及創(chuàng)新點
7.1.1 主要結(jié)論
7.1.2 創(chuàng)新點
7.2 展望
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文及參加科研情況說明
附錄
致謝
【參考文獻(xiàn)】
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4 陳濤;基于基因組重排的產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的代謝工程[D];天津大學(xué);2004年
本文編號：
2204290
