【摘要】：RNA外切核酸酶是修飾RNA的一個(gè)大的核酸酶家族,在許多生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。一方面RNA外切核酸酶可以通過(guò)降解多余的RNA來(lái)調(diào)節(jié)RNA的豐度,并由此來(lái)監(jiān)視RNA的代謝。同時(shí),一些RNA前體分子也需要通RNA外切核酸酶的剪切來(lái)形成成熟體。Dis312是存在于高等真核生物中的RNA外切核酸酶,在RNA的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,它從3’往5’逐個(gè)地降解單核苷酸。Dis312位于細(xì)胞質(zhì)中,在基因上與一些在細(xì)胞質(zhì)中參與RNA降解通路的分子有聯(lián)系。例如,在小鼠胚胎干細(xì)胞中Dis312通過(guò)降解尿苷化的pre-let-7來(lái)阻斷l(xiāng)et-7 microRNAs的表達(dá)。人源Dis312的突變可導(dǎo)致Perlman綜合征,引起過(guò)增長(zhǎng)并可引發(fā)Wilm's腫瘤。另有研究表明Dis312選擇性降解尿苷化的RNA分子,這種活性可被腺苷化的RNA分子所抑制。隨著最近幾年Dis312功能和催化性質(zhì)不斷地被報(bào)道,很多研究組也在進(jìn)行Dis312結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。在2014年小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解出(PDB序列號(hào)4pmw),該結(jié)構(gòu)和之前解出的Rrp44-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB序列號(hào)2nvu)以及RNase Ⅱ-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB序列號(hào)2ix1)都具有相似的構(gòu)象：三個(gè)OB折疊的結(jié)構(gòu)域(CSD1,CSD2和S1結(jié)構(gòu)域)位于負(fù)責(zé)催化的RNB結(jié)構(gòu)域的一側(cè),形成了RNA分子通道的入口,RNA底物從這個(gè)入口進(jìn)入RNB結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部,從而到達(dá)催化RNA降解的活性位點(diǎn)。但是在這三個(gè)RNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中,RNA通道還是有一些明顯的差異。例如,釀酒酵母Rrp44的三個(gè)OB折疊結(jié)構(gòu)域所形成的通道相比于Dis312顯得更窄,這是因?yàn)镃SDs的柔性loop在RNB以及S1結(jié)構(gòu)域的距離上更為緊密,呈現(xiàn)一種關(guān)閉的狀態(tài)；而在小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)中,三個(gè)OB折疊的結(jié)構(gòu)域的取向形成一個(gè)特別的漏斗狀通道,使得RNA通道顯得更加筆直和開(kāi)放。小鼠的Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析首次闡述了Dis312這種外切酶和RNA底物的作用方式,很好地解釋了Dis312選擇特異性結(jié)合尿苷酸鏈的原因。但是對(duì)于Dis312的催化機(jī)理仍然還有很多問(wèn)題有待挖掘。例如Dis312不結(jié)合RNA時(shí)的構(gòu)象,Dis312結(jié)合RNA的整體動(dòng)態(tài)過(guò)程等。為了繼續(xù)揭示Dis312的催化機(jī)制,本人解析了2.3A的裂殖酵母Dis312的不含RNA底物的結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)中CSDs的取向和小鼠Dis312-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)中CSDs的取向出現(xiàn)了很大差別,位于RNB結(jié)構(gòu)域的側(cè)面而遠(yuǎn)離RNB結(jié)構(gòu)域上方的RNA通道入口。從不含RNA的Dis312結(jié)構(gòu)和Rrp44、RNAseⅡ兩個(gè)同源物的RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)的比較中也出現(xiàn)了類似差別。對(duì)這種構(gòu)象上差別的可能原因分析結(jié)果表明,序列差異和晶體堆積對(duì)構(gòu)象差異的影響不大,而RNA的結(jié)合狀態(tài)的不同是不結(jié)合RNA的Dis312結(jié)構(gòu)和復(fù)合物結(jié)構(gòu)出現(xiàn)構(gòu)象差別的主要原因。熒光偏振實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示RNB和S1參與最初整個(gè)酶對(duì)RNA分子的結(jié)合；同時(shí)CSDs也參與結(jié)合的整個(gè)過(guò)程。結(jié)合結(jié)構(gòu)比對(duì)和突變體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以推測(cè),由于RNA的結(jié)合,Dis312可能會(huì)發(fā)生一個(gè)明顯的構(gòu)象變化。目前Dis312-RNA的結(jié)構(gòu)只有小鼠的被解析出來(lái),該工作解析出了首個(gè)不含RNA的Dis312晶體結(jié)構(gòu)。此外,該工作也同步解析裂殖酵母Dis312-RNA的結(jié)構(gòu),來(lái)探究Dis312在結(jié)合RNA前后構(gòu)象的變化。由于收到的復(fù)合物衍射數(shù)據(jù)分辨率不高,最終解析出的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中只確定了四分之三的肽鏈的走向(不含CSDs),但是通過(guò)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在已有的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型中,RNB和S1結(jié)構(gòu)域的電子密度和模型吻合度良好,這說(shuō)明這兩結(jié)構(gòu)域的主鏈走向和空間大致位置是基本準(zhǔn)確的�，F(xiàn)有的復(fù)合物模型和電子密度提供的信息,以及解析出來(lái)的裂殖酵母Dis312結(jié)構(gòu)模型一致表明,Dis312在結(jié)合RNA之前呈現(xiàn)一種較為開(kāi)放的狀態(tài),CSDs偏向RNB結(jié)構(gòu)域的側(cè)面而相聚S1結(jié)構(gòu)域較遠(yuǎn),結(jié)合RNA之后,CSDs會(huì)發(fā)生一定角度的位置變化,和S1結(jié)構(gòu)域一起形成鉗狀的結(jié)構(gòu)來(lái)包裹住RNA分子,從而大大提高Dis312對(duì)底物的親和力。
[Abstract]:RNA exonucleases, a large family of nucleases that modify RNA, play an important role in many life processes. On the one hand, RNA exonucleases can regulate RNA abundance by degrading excess RNA and thereby monitor RNA metabolism. At the same time, some RNA precursors also require cleavage of RNA exonucleases to form. Mature bodies. Dis312 is an RNA exonuclease present in higher eukaryotes and plays an important role in RNA degradation. It degrades mononucleotides one by one from 3'to 5'. Dis312 is located in the cytoplasm and is genetically associated with some molecules involved in RNA degradation pathways in the cytoplasm. For example, mouse embryonic stem cells. Dis312 inhibits the expression of let-7 microRNAs by degrading ureaylated pre-let-7. Human Dis312 mutations can lead to Perlman syndrome, overgrowth and Wilm's tumors. Other studies have shown that Dis312 selectively degrades ureaylated RNA molecules, which can be inhibited by adenylated RNA molecules. Functional and catalytic properties are continually reported, and many research groups are also working on the structural biology of Dis312. In 2014, the structure of the mouse Dis312-RNA complex (PDB sequence number 4pmw), the structure of the Rrp44-RNA complex (PDB sequence number 2nvu) and the structure of the RNase II-RNA complex (PDB sequence number 2ix1) have been released. All have similar conformations: three OB-folded domains (CSD1, CSD2, and S1) are located on one side of the catalytic RNB domain, forming the entrance of the RNA molecular channel from which the RNA substrate enters the interior of the RNB domain and reaches the active site for catalytic RNA degradation. For example, the channels formed by the three OB folding domains of Saccharomyces cerevisiae Rrp44 are narrower than those of Dis312, because the flexible loop of CSDs is more closely spaced between the RNB and S1 domains, presenting a closed state; and in the mouse's Dis312-RNA complex, the three OBs fold. The orientation of the domain forms a peculiar funnel-shaped channel that makes the RNA channel more straight and open. The structure of the mouse Dis312-RNA complex first elucidates the way Dis312 acts as an exonuclease and RNA substrate, which explains why Dis312 selectively binds to the uridine chain. In order to further reveal the catalytic mechanism of Dis312, the structure of 2.3A fission yeast Dis312 without RNA substrates, the orientation of CSDs and the CSDs in mouse Dis312-RNA complex structure were analyzed. The alignment varies greatly from side to side of the RNB domain and away from the entrance of the RNA channel above the RNB domain. Similar differences also occur in the comparison of the RNA complexes of two homologues, namely, DIS 312 and Rrp44, and RNAse II, which do not contain RNA. The results of fluorescence polarization experiments also showed that RNB and S1 were involved in the binding of the whole enzyme to RNA molecules, and CSDs were also involved in the binding process. The results of the mutant binding experiments suggest that a significant conformational change may occur in Dis312 due to RNA binding. At present, only mice have been able to identify the structure of Dis312-RNA. This work has identified the first crystal structure of Dis312 that does not contain RNA. In addition, the structure of Dis312-RNA in Schizosaccharomyces cerevisiae has been analyzed synchronously to explore Di. The conformational changes of S312 before and after binding RNA. Due to the low resolution of the complex diffraction data, only three-fourths of the peptide chains (excluding CSDs) were determined in the final structure of the complex. However, it was found that the electron density of RNB and S1 domains in the existing complex structure models was in good agreement with the model. The information provided by the existing complex model and electron density, as well as the structure model of the cleavage yeast Dis312, showed that Dis312 exhibited a relatively open state before binding RNA, and CSDs were inclined to the side of the RNB domain and aggregated S1. After binding to RNA, CSDs change their position at a certain angle and form clamp-like structures with S1 domain to encapsulate RNA molecules, thus greatly enhancing the affinity of Dis312 to substrate.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q617

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本文編號(hào)：2182444