本文關(guān)鍵詞：特異性定點共價固定化及�；尼尫琶窼T0779的非特異性催化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

特異性定點共價固定化及�；尼尫琶窼T0779的非特異性催化的研究

李蓉  

【摘要】：酶作為高效的生物催化劑在化工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境治理和檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是酶制劑存在著活性不穩(wěn)定、回收利用率差，容易受到外界因素如溫度、pH值等的影響而失活等問題而使其應(yīng)用受到了許多限制。酶固定化技術(shù)可以克服酶制劑在應(yīng)用中穩(wěn)定性差、重復(fù)利用率低等問題，因此越來越受到重視。 目前酶的固定化方法可分為非特異性固定化和特異性固定化。其中特異性固定化是通過對酶進行合理的設(shè)計和改造向酶蛋白中引進一些特殊的功能團，利用這些功能團可以使酶與載體進行特異性定點結(jié)合。此方法因可以針對性地提高酶活性、穩(wěn)定性或增強催化特異性而成為當(dāng)前的研究熱點。 本文采用特異性定點共價固定化方法進行研究。通過對酶進行合理的設(shè)計和改造，向酶蛋白中引入特異性反應(yīng)功能團——醛基，并利用此功能團定點與氨基載體進行共價固定化。此方法不僅可以通過合理地設(shè)計與選擇對進行酶有針對性的固定化，同時形成的共價鍵使酶與載體之間的固定更加牢固，不易脫落。我們利用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）能夠識別硫酸酯酶序列中高度保守序列LCXPXR，并可以催化其中的半胱氨酸轉(zhuǎn)化成含有一個醛基的甲酰甘氨酸（FGly）的特性。將這六個保守序列通過基因工程引入目標酶的蛋白氨基酸中，使目標蛋白經(jīng)FGE的催化修飾帶有特異性的醛基功能團，從而獲得含有醛基標簽的重組酶蛋白。以商用質(zhì)粒載體pET-28a為改造骨架，將其用于純化表達的組氨酸標簽（組氨酸標簽）替換為醛基標簽（醛基標簽），成為具有通用性的可以用于構(gòu)建含有特異性醛基標簽的重組蛋白表達載體。并且利用質(zhì)粒載體pET-28a在位于多克隆位點的N、C端分別含有一個組氨酸標簽的特點，我們構(gòu)建了四個表達載體亞型：無組氨酸標簽的pET-28aDH、N端含有醛基標簽的pET-28aNQ、C端含有醛基標簽的pET-28aCQ以及兩端均含有醛基標簽的pET-28aDQ。之后選用了4個不同來源的酶作為模式酶來構(gòu)建含有醛基標簽的酶，分別為嗜熱�；尼尫琶窼T0779、嗜熱酯酶APE1547、嗜熱脫氯酶ST2570以及脂肪酶LipA，并對不同位置引入醛基標簽對酶蛋白的表達和酶活的影響進行了系統(tǒng)研究。研究結(jié)果在蛋白的N、C端分別引起醛基標簽，其目的蛋白表達量及酶活力均受到不同程度的影響；而兩端同時引入醛基標簽，對蛋白的表達及酶活力都出現(xiàn)大幅度下降。同時對修飾后的酶進行了固定化研究，測定酶固定化效率、穩(wěn)定性以及回收利用率。結(jié)果顯示，固定化的穩(wěn)定化有所提高，固定化過程中有針對性無醛基標簽蛋白不能固定于載體上。 一直以來酶都被認為是具有專一性、特異性，只對一類反應(yīng)具有高度識別性的生物催化劑，但是最近一些研究發(fā)現(xiàn)一些酶能夠利用主反應(yīng)的活性位點催化不同于其主要酶活性反應(yīng)，即為酶的催化非特異性。此特性不僅拓展了酶促有機合成的反應(yīng)類型，提高了酶在有機合成領(lǐng)域的應(yīng)用價值，同時也對研究不同酶的進化關(guān)系提供重要的線索。其中研究最為廣泛的是來自/β水解酶家族一類絲氨酸水解酶，可催化C-C和C-N鍵形成的反應(yīng)。嗜熱�；尼尫琶窼T0779屬于/β水解酶家族，其催化三聯(lián)體與脂肪酶的催化三聯(lián)體相一致，我們推測其也可能具有酶的催化非特異性特性。本論文首次嘗試研究并發(fā)現(xiàn)ST0779可以進行非特異性催化aldol反應(yīng)。脂肪酶PPL是目前研究報道中非特異性催化aldol反應(yīng)效果最好的酶。因此我們用脂肪酶PPL作為對照來比較反應(yīng)速率、產(chǎn)率以及產(chǎn)物的立體選擇性。實驗發(fā)現(xiàn)，以4-對硝基苯甲醛和丙酮為底物，在55℃下ST0779催化4h即可達到96.1%的轉(zhuǎn)化率。而PPL在30℃催化48h才達到39.2%的轉(zhuǎn)化率，ST0779的非特異性催化aldol反應(yīng)效率要高于目前已報道過的酶非特異性催化aldol反應(yīng)效率。 為了更好的理解ST0779和PPL非特異性催化aldol反應(yīng)機理，我們通過熒光光譜來研究底物分子丙酮、對硝基苯甲醛與酶分子之間相互作用。通過分析得到底物與蛋白的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點以及結(jié)合力類型，結(jié)合酶分子結(jié)構(gòu)來解釋ST0779非特異性催化aldol反應(yīng)的機制。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q814.2
【目錄】：

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