發(fā)布時(shí)間：2018-06-21 23:34

  本文選題：核酸檢測(cè) + 微流控��； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：具有高度多樣性與特異性的核酸分子作為生物標(biāo)志物能對(duì)不同種類生物物種、個(gè)體乃至單個(gè)基因進(jìn)行識(shí)別與檢測(cè)。2006年Nature雜志撰文提出了由世界衛(wèi)生組織制定的滿足發(fā)展中地區(qū)傳染疾病診斷需求的ASSURED標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn),近年來人們致力于解決核酸檢測(cè)過程中的各項(xiàng)技術(shù)難點(diǎn),簡化操作步驟,提高檢測(cè)性能與效率以及降低用戶使用難度,使之滿足現(xiàn)場即時(shí)檢測(cè)的各項(xiàng)挑戰(zhàn)。為解決現(xiàn)有核酸定性與定量檢測(cè)方法中存在的不足與問題,尤其針對(duì)現(xiàn)場即時(shí)診斷應(yīng)用中的局限,本文結(jié)合微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),研究了基于旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片與離心式數(shù)字?jǐn)U增芯片的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸定性與定量可視化檢測(cè)方法,將有可能為疾病診斷、生化分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)鑒定以及食品安全等各個(gè)領(lǐng)域提供新型核酸分析技術(shù)平臺(tái)。首先,建立了一種半封閉式的微流控旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片平臺(tái),并將其成功應(yīng)用于可視化環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中。通過對(duì)芯片玻璃表面進(jìn)行疏水修飾,實(shí)現(xiàn)了多種液樣的載入與平行混合反應(yīng),避免了漏液以及交叉污染,并以熒光淬滅混合反應(yīng)進(jìn)行了方法驗(yàn)證與評(píng)價(jià),成功表征了跨越近3個(gè)濃度數(shù)量級(jí)的熒光反應(yīng)。自制了基于帕爾貼熱電半導(dǎo)體的專用小型加熱系統(tǒng)用以對(duì)芯片等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行溫度快速控制與維持,可使芯片內(nèi)樣品5min之內(nèi)達(dá)到反應(yīng)溫度。通過測(cè)試銅離子、納米銀以及pH條件對(duì)熒光指示劑淬滅效率的影響,優(yōu)化及實(shí)現(xiàn)了可視化芯片等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法并達(dá)到了4～5倍的陽性/陰性熒光強(qiáng)度比,同時(shí)單孔反應(yīng)試劑消耗體積降低至0.7μL。最后,系統(tǒng)探討了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中的產(chǎn)物污染管控問題,并確定了可消除檢測(cè)假陽性的體系設(shè)置與操作模式。其次,在已建立的可視化芯片等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法基礎(chǔ)上,針對(duì)包括蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、河流弧菌以及副溶血弧菌在內(nèi)的五種消化道常見病原菌進(jìn)行了定性檢測(cè)研究。通過對(duì)包含內(nèi)引物、脫氧核糖核苷三磷酸、嗜熱脂肪芽孢桿菌核酸聚合酶、甜菜堿及鎂離子在內(nèi)的擴(kuò)增體系主要成分進(jìn)行芯片濃度優(yōu)化擴(kuò)增測(cè)試,確定了各組分最優(yōu)化工作濃度。在這一反應(yīng)條件下成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)河流弧菌的可視化芯片檢測(cè),獲得了約7.2copies/μL的檢測(cè)極限,同時(shí)驗(yàn)證了自行設(shè)計(jì)引物的良好特異性。最后,成功實(shí)現(xiàn)了多病原體的芯片可視化同步檢測(cè)并且與芯片外常規(guī)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了對(duì)照,取得了不錯(cuò)的一致性。隨后,基于泊松統(tǒng)計(jì)以及化學(xué)計(jì)量學(xué)基本理論,建立了數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增定量檢測(cè)方法的數(shù)學(xué)模型,利用科學(xué)計(jì)算與可視化工具對(duì)該模型進(jìn)行了蒙特卡洛模擬分析并驗(yàn)證了極大似然估計(jì)計(jì)算方法的有效性與可靠性。分別計(jì)算了擴(kuò)增元數(shù)為1200與12000時(shí)數(shù)字定量方法的精度,準(zhǔn)度與動(dòng)態(tài)范圍等技術(shù)參數(shù),并基于理論計(jì)算將其與基于Ct值的實(shí)時(shí)定量方法進(jìn)行了優(yōu)劣比較并分析了兩者的定量分辨率。最后,本文特別設(shè)計(jì)研制了用于核酸絕對(duì)定量檢測(cè)的離心式數(shù)字?jǐn)U增芯片并對(duì)樣品離散化方式,溫度控制以及防蒸發(fā)效果進(jìn)行了測(cè)試與驗(yàn)證。該芯片擴(kuò)增元體積及光強(qiáng)分布較為平均,變異系數(shù)分別為2.27%與0.676%,且完全能滿足肉眼或便攜光學(xué)傳感器的檢測(cè)需求,可有效降低核酸定量檢測(cè)分析成本。最后,結(jié)合離心式數(shù)字?jǐn)U增芯片以及可視化等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)河流弧菌病原體載量進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)化了反應(yīng)溫度,反應(yīng)酶活,反應(yīng)時(shí)間等擴(kuò)增反應(yīng)條件,并比較了不同成像條件對(duì)數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增定量結(jié)果的影響。該芯片方法能有效的對(duì)跨越4個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的病原菌基因組核酸進(jìn)行定量分析,結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果一致。相較于本文的定性方法,檢測(cè)極限進(jìn)一步低至8.7×10-2copies/μL,檢測(cè)時(shí)間縮短至40min,并且單次檢測(cè)極具成本效益。通過結(jié)合定制的帕爾貼熱電半導(dǎo)體加熱器與便攜光學(xué)傳感器,該定量方法擺脫了對(duì)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)器或熱循環(huán)設(shè)備的依賴,滿足了現(xiàn)場即時(shí)診斷的應(yīng)用需求。
[Abstract]:A semi - closed microflow control rotary reaction chip platform is established , which can be used in the isothermal amplification of nucleic acid . The test and verification of the temperature control and the anti - evaporation effect are carried out . The amplification unit volume and the intensity distribution of the chip are average , the coefficient of variation is 2 . 27 % and 0 . 676 % respectively , and the effect of different imaging conditions on the quantitative result of digital isothermal amplification can be effectively reduced .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q503;R440
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本文編號(hào)：2050521