本文選題：紫花苜蓿 + γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶��； 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是異花授粉的同源四倍體且基因組龐大,復(fù)雜的遺傳背景限制了其有價(jià)值基因的發(fā)掘和利用。維生素E的合成途徑在多個(gè)物種中都進(jìn)行了深入研究,然而關(guān)于紫花苜蓿維生素E的合成卻鮮有報(bào)道。為了提高紫花苜蓿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,優(yōu)化紫花苜蓿的維生素E含量和組分,本研究以紫花苜蓿中苜一號(hào)(Medicago Sativa L. vs Zhongmu No.l)為材料克隆得到維生素E合成途徑的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(y-TMT),尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(HPT)和4-羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)并進(jìn)行研究,取得如下進(jìn)展：1.以紫花苜蓿葉片為實(shí)驗(yàn)材料,采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆得到γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(y-TMT)。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明,紫花苜蓿MsTMT與截形苜蓿MtTMT高度同源,說(shuō)明我們成功從紫花苜蓿中克隆得到了y-TMT并將其命名為MsTMT.熒光定量PCR分析結(jié)果表明,該基因在整株植物中均有表達(dá),其中葉片中表達(dá)量最高,花中表達(dá)量最低。NaCl、15%PEG、黑暗和脫落酸均可以誘導(dǎo)MsTMT的表達(dá),而低溫則抑制MsTMT的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中α-生育酚的含量顯著增加,葉片中維生素E的組分和含量則沒(méi)有變化。同時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)源維生素E合成基因的表達(dá)量均未受到影響。甘露醇處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率,以及生物量顯著高于對(duì)照,CAT和POD活性在轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著提高,而且滲透脅迫的標(biāo)志基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著上調(diào),說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥與對(duì)照相比抗逆性增強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片中α-生育酚和α-生育三烯酚含量以及粗蛋白的含量均有增加,并且在黑暗誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的衰老與對(duì)照相比有所延緩。說(shuō)明MsTMT在不影響紫花苜蓿品質(zhì)的同時(shí)還可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的葉片衰老過(guò)程,因此可以做為紫花苜蓿品質(zhì)改良的候選基因。2.以紫花苜蓿葉片為實(shí)驗(yàn)材料,采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆得到尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(HPT)的cDNA序列,該基因有一個(gè)1236bp的完整開(kāi)放閱讀框,編碼411個(gè)氨基酸,屬于異戊烯轉(zhuǎn)移酶UbiA家族,有異戊烯轉(zhuǎn)移酶HPT1保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)分析結(jié)果顯示,該蛋白與其他物種的HPT高度同源,蛋白序列相似度達(dá)80%,由此證明我們成功克隆得到紫花苜蓿HPT基因,并命名為MsHPT。通過(guò)染色體步移技術(shù)獲得1.9Kb啟動(dòng)子序列,序列分析表明,紫花苜蓿MsHPT啟動(dòng)子區(qū)域除含有大量的核心啟動(dòng)子元件TATA和CAAT之外,還有脫落酸、乙烯、赤霉素、榮莉酸甲酯等激素反應(yīng)元件以及大量的與光反應(yīng)有關(guān)的作用元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析MsHPT在各組織中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明,MsHPT基因在根、莖、葉中均有表達(dá),葉片中表達(dá)量最高。15%PEG,NaCl,赤霉素和脫落酸均可一定程度上誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。該基因?qū)γ{迫的廣泛響應(yīng),說(shuō)明該基因可能在紫花苜�？鼓嫘陨暇哂幸欢ǖ淖饔�。3. 以紫花苜蓿葉片為實(shí)驗(yàn)材料,采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆得到紫花苜蓿4-羥基丙酮酸轉(zhuǎn)移酶cDNA, cDNA序列分析結(jié)果表明,其包含1305bp的開(kāi)放閱讀框,編碼434個(gè)氨基酸,屬于Glo_EDI_BRP_like超家族,在序列的C和N末端各包含一個(gè)HPPD結(jié)構(gòu)域,并且C端富含活性位點(diǎn)。多序列比對(duì)結(jié)果表明,紫花苜蓿HPPD與來(lái)自其他物種的HPPD相似性達(dá)到82.46%,三個(gè)決定該酶活性的鐵結(jié)合位點(diǎn)在不同的HPPD中高度保守,因此我們將該基因命名為MsHPPD。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,MsHPPD在紫花苜蓿的各個(gè)組織中均有表達(dá),其中在葉片中表達(dá)量最高。通過(guò)染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動(dòng)子序列,并連入pBI121載體中,通過(guò)GUS染色分析結(jié)果表明,MsHPPD在擬南芥的子葉,主根,萼片,花瓣,柱頭,絲管,花粉以及種子果莢的末端都有強(qiáng)烈的GUS表達(dá)。真葉,根尖以及下胚軸中沒(méi)有GUS的表達(dá)。NaCl、脫落酸、PEG和黑暗都可以誘導(dǎo)MsHPPD的表達(dá)。將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥,轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中p-生育三烯酚以及維生素E總量含量顯著高于對(duì)照。且轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在正常環(huán)境下發(fā)芽時(shí)間顯著早于對(duì)照,而在甘露醇和NaCl處理?xiàng)l件下發(fā)芽率顯著高于對(duì)照,并且對(duì)ABA處理不敏感。ABA含量測(cè)定結(jié)果表明,在干種子中ABA的含量在轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照中差異不顯著,但在浸水36h的種子中,轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA的含量顯著低于對(duì)照。同時(shí),在干種子中,ABA合成基因NCED3,5,9以及ABA信號(hào)途徑的基因ABI3和AB15的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照中表達(dá)差異不顯著,而浸水后,表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著降低。而MsHPPD的表達(dá)量在浸水顯著升高。將pBI121-MsHPPD-GUS雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后,轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片中維生素E的含量不變,但是粗蛋白含量與對(duì)照相比顯著提高。
[Abstract]:In order to improve the nutritional value of alfalfa and to optimize the content of vitamin E in transgenic Arabidopsis thaliana , the expression of 偽 - tocopherol and 偽 - tocotrienol in transgenic Arabidopsis was significantly increased . Real - time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the relative expression of MsHin various tissues . The results showed that the expression of MsHAs in roots , stems and leaves was the highest . 15 % PEG , NaCl , GA and ABA could induce the expression of the gene . The results showed that the content of the gene ABI3 and AB15 in the transgenic Arabidopsis was significantly higher than that of the control . The results showed that the content of the gene ABI3 and AB15 in the transgenic Arabidopsis was significantly higher than that of the control .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2043101