本文選題：煙草 + 激活標(biāo)簽��； 參考：《西南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：煙草是我國(guó)種植面積最廣的經(jīng)濟(jì)作物之一,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。煙葉質(zhì)量是煙草經(jīng)濟(jì)價(jià)值的直接體現(xiàn)。其中,煙堿是衡量煙葉化學(xué)品質(zhì)的重要指標(biāo),也是影響人們健康的關(guān)鍵因素,適堿少害煙草一直是煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。生產(chǎn)上,傳統(tǒng)家系選擇法和雜交育種法具有育種周期長(zhǎng)、工作量大及優(yōu)良性狀遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn),在生物技術(shù)快速發(fā)展的今天,有必要利用分子生物學(xué)技術(shù)手段,通過(guò)篩選煙草煙堿突變體揭示其分子機(jī)理,為煙草低堿品種選育與栽培實(shí)踐提供理論支撐和生產(chǎn)參考。茉莉素信號(hào)途徑參與煙堿合成代謝和植物抗病調(diào)控,茉莉酸可以影響種子萌發(fā)和根發(fā)育,本研究以此為依據(jù),基于茉莉酸敏感性從煙草激活標(biāo)簽突變體庫(kù)中篩選煙堿突變體,并對(duì)突變體進(jìn)行生理分析和分子鑒定。主要結(jié)果如下:1.茉莉酸輔助篩選煙草煙堿激活標(biāo)簽突變體(1)開(kāi)發(fā)了一種高通量篩選煙草激活標(biāo)簽突變體庫(kù)的新方法:茉莉酸敏感性輔助篩選煙堿突變體。首先,在茉莉酸選擇壓力下篩選萌發(fā)時(shí)間和根長(zhǎng)與對(duì)照存在差異的突變體;其次,以這些突變體為材料,通過(guò)測(cè)定打頂前后煙堿含量篩選煙堿突變體;然后,進(jìn)一步篩選在三代內(nèi)保持穩(wěn)定的茉莉酸敏感性和煙堿含量的的突變體。這個(gè)突變體篩選方法簡(jiǎn)單高效、省財(cái)省力,同時(shí)具有挖掘茉莉酸介導(dǎo)的煙堿合成新基因的潛能。(2)在3000份T1代煙草激活標(biāo)簽突變體庫(kù)中篩出48個(gè)萌發(fā)時(shí)間和根長(zhǎng)具有異常的茉莉酸敏感性的突變體。進(jìn)一步篩選后一共找到8個(gè)煙堿含量異常的突變體,它們?cè)?代內(nèi)保持穩(wěn)定的茉莉酸敏感性和煙堿含量。這些突變體可以分為兩類(lèi),第一類(lèi)的5個(gè)突變體在打頂前后具有相同級(jí)別的煙堿含量,分別命名為nit3、nit6、nit7、nit9和nit10。其中nit3和nit6為偏低煙堿突變體,對(duì)茉莉酸低敏感;nit7為偏高煙堿突變體,對(duì)茉莉酸敏感;nit9和nit10為高煙堿突變體,對(duì)茉莉酸高敏感。第二類(lèi)的3個(gè)突變體在打頂前后具有不同級(jí)別的煙堿含量,我們將其稱(chēng)為特殊煙堿突變體,分別命名為nit11、nit14、nit17,其中nit11的煙堿含量在打頂前偏低打頂后偏高,對(duì)茉莉酸不敏感;nit14的煙堿含量在打頂前偏低打頂后高,對(duì)茉莉酸低敏感;nit17的煙堿含量在打頂前高打頂后偏低,對(duì)茉莉酸高敏感。2.突變體的生理特性以第一類(lèi)的5個(gè)煙堿突變體和第二類(lèi)的3個(gè)特殊煙堿突變體為材料,測(cè)定了茉莉酸甲酯(Me JA)處理及打頂前和處理1天、14天、28天的碳氮代謝酶(INV、GS)活性。同時(shí)測(cè)定了處理前與Me JA處理及打頂28天的總氮含量、可溶性糖含量,內(nèi)源激素含量(ABA、IAA、GA、ZR)和光合指標(biāo)(葉綠素含量、凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度)。結(jié)果如下:(1)第一類(lèi)5個(gè)煙堿突變體的煙堿含量與INV、GS活性負(fù)相關(guān),與總氮含量正相關(guān);Me JA處理和打頂能明顯降低煙草的GS活性,煙堿含量越高,Me JA處理和打頂對(duì)總氮含量的提高越明顯;煙堿含量與植物激素ABA正相關(guān),與IAA和GA負(fù)相關(guān),Me JA處理和打頂可以明顯降低突變體IAA和GA含量;煙堿含量與葉綠素含量、凈光合速率、胞間CO2濃度負(fù)相關(guān),與氣孔導(dǎo)度正相關(guān),煙堿含量越高,Me JA處理和打頂對(duì)氣孔導(dǎo)度的提高越明顯。(2)第二類(lèi)3個(gè)特殊煙堿突變體煙堿含量在打頂前后變化異常,其生理特性與第一類(lèi)5個(gè)煙堿突變體存在差異,nit11煙堿含量在打頂后大幅增加,可能與可溶性糖含量上升、與ABA含量增加以及葉綠素含量和凈光合速率下降有關(guān)。nit14的煙堿含量在打頂后大幅增加可能與GA含量增加和氣孔導(dǎo)度升高有關(guān)。nit17的煙堿在打頂后降低可能與總氮含量增加、可溶性糖含量下降、IAA和GA含量下降以及葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度升高有關(guān)。3.突變體分子特性(1)對(duì)突變體進(jìn)行Bar基因檢測(cè),結(jié)果表明8個(gè)突變體均含有p SKI015激活標(biāo)簽;Southern雜交結(jié)果表明煙堿突變體nit6、nit9有兩個(gè)T-DNA插入基因組中,nit3、nit7和nit10各有一個(gè)T-DNA插入基因組中;特殊煙堿突變體nit11有兩個(gè)T-DNA插入基因組中,nit14和nit17各有一個(gè)T-DNA插入基因組中。(2)突變體的茉莉酸敏感性和Nt MYC2的表達(dá)水平高度一致。(3)第一類(lèi)5個(gè)煙堿突變體中煙堿合成基因的表達(dá)水平受JA的影響,且與JA誘導(dǎo)煙堿合成的作用機(jī)理相吻合;第二類(lèi)3個(gè)特殊煙堿突變體中煙堿合成基因的表達(dá)水平受JA的影響,但每個(gè)突變體具有不同的基因表達(dá)模式,Me JA處理前,nit11的Nt BBL基因表達(dá)量低于對(duì)照HD,Me JA處理后,Nt BBL基因表達(dá)量明顯升高,Nt PMT基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照。nit14的Nt ODC基因表達(dá)量在Me JA處理前后均低于對(duì)照HD;Nt A622基因的表達(dá)量在Me JA處理前后均明顯高于對(duì)照;Nt PMT基因在Me JA處理前表達(dá)量高,Me JA處理后表達(dá)量明顯降低,Nt BBL基因在Me JA處理后不被誘導(dǎo),Nt NUP1基因在Me JA處理后表達(dá)量大幅增加。nit17的大部分煙堿合成基因表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異,而煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因Nt NUP1的表達(dá)量在Me JA處理前后均明顯低于對(duì)照。4.突變體側(cè)翼序列獲得及候選基因預(yù)測(cè)(1)以第一類(lèi)5個(gè)煙堿突變體和第二類(lèi)3個(gè)特殊煙堿突變體的T4代為材料,用FPNI-PCR、TAIL-PCR、單引物PCR、IPCR和質(zhì)粒拯救共5種方法擴(kuò)增突變體側(cè)翼序列,經(jīng)比較可知,優(yōu)化后的FPNI-PCR法擴(kuò)增側(cè)翼序列效果最好,可以作為煙草激活標(biāo)簽T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增的首選方法。(2)最終獲得10條不同的側(cè)翼序列,與煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后特殊煙堿突變體nit11、nit14和nit17的側(cè)翼序列可以找到同源蛋白,其中nit11找到2個(gè)插入位點(diǎn)附近基因,在煙草基因組中的命名分別為Ntab0396680和Ntab0396670。nit14找到2個(gè)插入位點(diǎn)附近基因,在煙草基因組中的命名分別為Ntab0583900和Ntab0583910。nit17找到4個(gè)插入位點(diǎn)附近基因,在煙草基因組中的命名分別為Ntab0555610、Ntab0555600、Ntab0555620、Ntab0555630。(3)經(jīng)基因表達(dá)量分析后nit11、nit14和nit17各確定了一個(gè)候選基因,nit11的候選基因編號(hào)為D1-2,對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱(chēng)為Ntab0396670;nit14的候選基因編號(hào)為D4-1,對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱(chēng)為Ntab0583900;nit17的候選基因編號(hào)為D7-1,對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱(chēng)為Ntab0555610。(4)對(duì)3個(gè)突變體的候選基因進(jìn)行茉莉酸應(yīng)答分析,其中nit17的候選基因Ntab0555610(D7-1)在Me JA處理后少量增加。5.nit17的候選基因分析(1)為了驗(yàn)證nit17的突變表型是由T-DNA插入引起,我們對(duì)nit17的10個(gè)T2代分離株系進(jìn)行共分離鑒定,結(jié)果表明nit17的突變是由T-DNA插入引起,突變表型在后代發(fā)生了分離,在同一株系有突變表型的植株存在雜合基因型,說(shuō)明該突變是T-DNA單基因控制的顯性突變。(2)特殊煙堿突變體nit17的候選基因Ntab0555610與多向耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PDR1同源,我們將其命名為NtPDR30。構(gòu)建帶有e GFP的NtPDR30基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系,在接種煙草白粉病后轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株和nit17均具有抗病性。(3)對(duì)NtPDR30蛋白進(jìn)行了不同物種間的同源性比較、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)NtPDR30蛋白與其它物種PDR蛋白具有較高的同源性,NtPDR30蛋白具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特有的NBD-TMD-NBD-TMD結(jié)構(gòu),并在植物細(xì)胞膜上表達(dá)。(4)分析了茉莉酸處理前后普通煙草紅花大金元(HD)不同組織的NtPDR30基因表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)NtPDR30在煙草根中被茉莉酸誘導(dǎo)。(5)突變體nit17和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株T0在打頂和接種EDC后煙堿含量下降。nit17的煙堿合成基因的表達(dá)量并未改變,推測(cè)nit17煙堿含量下降是煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降造成,這可能是因?yàn)镹tPDR30基因過(guò)表達(dá)后,大大增強(qiáng)了NtPDR30蛋白對(duì)其特定轉(zhuǎn)運(yùn)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而降抑制了煙堿合成后的運(yùn)輸。(6)茉莉素調(diào)控的煙堿代謝和病害抗性之間存在緊密關(guān)聯(lián)。
[Abstract]:Tobacco is one of the most widely cultivated economic crops in China . It has important status in the national economy and agricultural production . The quality of tobacco leaves is a direct reflection of tobacco economic value . A mutant named nit3 , nit6 , nit7 , nit9 and nit10 was identified as nit3 , nit6 , nit7 , nit9 and nit10 . The results showed that : ( 1 ) The nicotine content of the first type 5 nicotine mutants was negatively correlated with the activity of INV and GS and was positively correlated with the total nitrogen content ; the higher the content of nicotine , the higher the content of IAA and GA , the higher the content of chlorophyll , the higher the content of IAA and GA , the higher the chlorophyll content , the net photosynthetic rate and the stomatal conductance . ( 3 ) The expression level of Ntab0396680 and Ntab0396670.nit14 in the tobacco genome was significantly lower than that of the control group . The expression of Ntab0396680 and Ntab0396670 . nit14 in the tobacco genome was significantly lower than that of the control group . ( 3 ) The candidate gene Ntab0555610 ( D7 - 1 ) of nit17 was identified as Ntab0396670 ; the candidate gene Ntab0555610 ( D7 - 1 ) of nit17 had high homology with other species , Ntab0555610 ( D7 - 1 ) was identified by T - DNA insertion .
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
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本文編號(hào)：1946160