本文選題：Zdhhc15b + DHHC蛋白�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說,多肽鏈翻譯后還要進(jìn)行多種加工修飾才具備生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式有：磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化等等。棕櫚�；鳛橹|(zhì)化修飾方式的一種,其功能是由DHHC蛋白質(zhì)執(zhí)行的。DHHC蛋白最早是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的,正向遺傳篩選結(jié)果表明Erf2/Erf4和Akrl是酵母中的DHHC蛋白,都富含特征性鋅指樣(Zinc finger)-DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)RAS2和酵母酪蛋白激酶2的修飾。除了在酵母已確定的7種DHHC蛋白,哺乳動物已發(fā)現(xiàn)23種DHHC家族成員,這些DHHC蛋白又被細(xì)分為不同的亞家族。2004年,Bredt DS研究小組完成了人類及小鼠基因組23種DHHC基因的克隆與鑒定,與此同時,蛋白質(zhì)組學(xué)和影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,加速了人們對這類蛋白功能的認(rèn)識。家族遺傳分析結(jié)果表明DHHC蛋白質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和相關(guān)神經(jīng)疾病的病發(fā)過程中起到重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),對于精神分裂癥和其它精神障礙來說DHHC8是一個高風(fēng)險因素；ZDHHC12參與淀粉樣前體蛋白(APP)的運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié),提示ZDHHC12可能參與阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease, AD)的發(fā)生；DHHC17被鑒定為亨廷頓相互作用蛋白；染色體X和ZDHHC15基因之間的平衡相互易位導(dǎo)致ZDHHC15轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺失,造成X連鎖精神發(fā)育遲滯(X-linked mental retardation, XLMR);另據(jù)報道ZDHHC9突變與XLMR相關(guān)。隨著對DHHC蛋白底物研究的日益深入,人們發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)蛋白可被DHHC蛋白修飾,從而在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,如突觸的形成和生長、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、離子通路的調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞生長、命運(yùn)決定等。研究表明DHHC3參與突觸功能作用；而DHHC5參與體外培養(yǎng)的神經(jīng)元分化過程。上述研究提示DHHC蛋白家族成員在神經(jīng)系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)的建立以及功能的完善過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用,但具體的作用機(jī)制還不清楚。因此闡明DHHC蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制成為近年來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。此外,隨著生活節(jié)奏的加快,抑郁癥的發(fā)病率逐年上升。雖然人類在抑郁癥的研究方面付出了大量的努力,但對其發(fā)病機(jī)制仍知之甚少。同時,抗抑郁藥發(fā)揮其治療作用的分子和細(xì)胞機(jī)制尚未給出很好的解釋。早期關(guān)于抑郁癥的病理生理學(xué)假說是基于主要的神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色氨(5-hydroxy tryptamine,5-HT)和去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE)的釋放減少。因此,5-羥色氨和去甲腎上腺素成為目前抑郁癥治療的措施和藥物開發(fā)的主要目標(biāo)。但隨著神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展,簡單的神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說無法解釋抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。最近,神經(jīng)元的神經(jīng)生成作用的降低為抑郁癥提供了嶄新的生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究基礎(chǔ)。有研究表明抗抑郁藥可能會促進(jìn)神經(jīng)元再生增加細(xì)胞數(shù)目從而達(dá)到治療抑郁癥的目的,但具體的作用機(jī)制還尚未明確。隨著斑馬魚基因組測序工程的完成,人們發(fā)現(xiàn)斑馬魚的基因與人類的基因保守程度達(dá)到85%；此外,斑馬魚胚胎透明,可以在鏡下準(zhǔn)確觀察其組織器官的發(fā)育過程以及基因在生物體內(nèi)的表達(dá)模式,使得斑馬魚成為研究人類疾病的理想模式動物。同時,斑馬魚胚胎發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)的逐步建立和完善也為斑馬魚的人類疾病模型的建立和分析提供了良好的基礎(chǔ)。本實驗用斑馬魚作為模式動物,同時探討了DHHC家族成員Zdhhcl5b以及抗抑郁藥物bupropion在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用及機(jī)制。第一章Zdhhcl5b基因調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎間腦多巴胺能神經(jīng)元分化的研究背景介紹DHHC 15 (zinc finger DHHC-type containing 15)是哺乳動物23種DHHC蛋白中的第15號成員。該基因是由332個氨基酸組成的跨膜蛋白,具有四個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD (Cysteine rich domain)特征結(jié)構(gòu)域。與其他成員相比,目前對DHHC 15的研究報道還比較少,且停留于體外水平。據(jù)報道,DHHC 15與X連鎖精神發(fā)育遲滯相關(guān),且DHHC 15可以修飾相應(yīng)的神經(jīng)蛋白,這提示DHHC15在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用。但是,DHHC15在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的功能和機(jī)制尚不明確。分析斑馬魚DHHC基因發(fā)現(xiàn)Zdhhcl5b與哺乳動物DHHC 15同源且兩者編碼的氨基酸序列高度保守。因此,本研究利用斑馬魚作為模式動物,通過注射norpholino建立人類DHHC 15的同源基因Zdhhcl5b的下調(diào)模型,利用斑馬魚胚胎整封原位雜交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、整封免疫熒光、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、免疫組化、行為學(xué)檢測等方法研究Zdhhcl5b對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,并深入探討了其在斑馬魚間腦多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neurons, DA neuron)分化中的作用及其機(jī)制。研究內(nèi)容首先,為了了解Zdhhcl5b在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式,本課題設(shè)計了Zdhhcl5b的特異性引物及地高辛標(biāo)記的反義RNA探針,利用RT-PCR和原位雜交(whole-mount in situ hybridization, WISH)技術(shù)檢測Zdhhcl5b在斑馬魚胚胎發(fā)育各時期的表達(dá)以及分布情況。原位雜交結(jié)果顯示,Zdhhcl5b是母源性表達(dá),并且從18hpf到48hpf, Zdhhcl5b大量存在于腦區(qū),尤其是間腦。RT-PCR實驗結(jié)果顯示Zdhhcl5b的表達(dá)從75%外包期開始增加,18hpf到72hpf逐漸達(dá)到峰值。提示Zdhhcl5b可能在斑馬魚間腦發(fā)育中的特定階段發(fā)揮重要作用。為了確定Zdhhcl5b是否作用于斑馬魚間腦發(fā)育,本實驗利用反向遺傳學(xué)手段,設(shè)計合成Zdhhcl5b morpholino (MO),在斑馬魚胚胎發(fā)育1cell時期進(jìn)行顯微注射建立Zdhhcl5b下調(diào)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Zdhhcl5b抑制后斑馬魚發(fā)育至24hpf時出現(xiàn)間腦發(fā)育缺陷。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Zdhhcl5b基因下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙。提示Zdhhcl5b參與斑馬魚間腦發(fā)育并在此過程中發(fā)揮重要作用。多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron, DA neuron),作為脊椎動物間腦的重要組成部分,在認(rèn)知、運(yùn)動控制和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Zdhhcl5b下調(diào)表達(dá)引起的間腦發(fā)育缺陷和學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙促使本課題進(jìn)一步研究Zdhhcl5b在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中的潛在作用。酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine transporter, DAT)是多巴胺能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物。首先,TH免疫熒光發(fā)現(xiàn)TH與Zdhhc15b表達(dá)區(qū)域重疊,這是Zdhhc15b可能會參與多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育的直接證據(jù)。其次,RT-PCR結(jié)果顯示Zdhhc15b基因下調(diào)后TH/DAT表達(dá)量在24hpf明顯降低,而膠質(zhì)細(xì)胞和運(yùn)動神經(jīng)48hpf元標(biāo)記物的表達(dá)沒有明顯變化,這一結(jié)果提示特異性地作用于多巴胺Zdhhc15b能神經(jīng)元發(fā)育。為了驗證這一推論,本研究采用TH和DAT原位雜交、TH整封免疫熒光、TH蛋白質(zhì)印跡(WB)等技術(shù)檢測TH和在DAT和蛋白水平mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,基因下調(diào)后斑馬魚腹側(cè)間腦Zdhhc15b標(biāo)記的TH/DAT陽性多巴胺能神經(jīng)元較少,且TH蛋白質(zhì)表達(dá)量降低。以上結(jié)果提示特異性地參與了斑馬魚腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育過程。Zdhhc15b多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞捕獲分化信號獲得分化特征,最終成長為成熟的多巴胺能神經(jīng)元。為了研究影響多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的具體階段,首先Zdhhc15b進(jìn)行了原位雜交和BrdU摻入實驗。結(jié)果分析表明,PCNA下調(diào)前后Zdhhc15b多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖周期與對照相比無明顯變化。因此推斷,對多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖沒有影響；多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)Zdhhc15b胞增殖的結(jié)果就是多巴胺前體神經(jīng)元的增加,ngnl是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記物。為了進(jìn)一步檢測對多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞特性獲得的影響,開展了Z dhhc15b原位雜交實驗。結(jié)果顯示,ngn1在ngn1下調(diào)前后等量表達(dá),這表明多Zdhhc15b巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的特性獲得與的作用無關(guān)；接下來為了檢測Zdhhc15b對多巴胺能神經(jīng)元存活的影響,本實驗用吖啶橙染色法檢測巴胺能神Zdhhc15b經(jīng)元的凋亡情況。染色結(jié)果表明,細(xì)胞凋亡在下Zdhhc15b調(diào)前后沒有明顯變化,提示不影響多巴胺能神經(jīng)元的凋亡；接下來為了確定多巴胺能神經(jīng)元Zdhhc15b分化過程是否需要調(diào)節(jié),本課題進(jìn)行了多巴胺能神經(jīng)元分化相關(guān)基因Zdhhc15b的原位雜交實驗和其他相關(guān)因子的nurr1篩選實驗。RT-PCR是多巴胺能神Nurr1經(jīng)元分化的標(biāo)記物,原位雜交結(jié)果顯示,在基因下調(diào)后其表達(dá)量明顯Zdhhc15b降低。同時,結(jié)果顯示,參與多巴胺能神經(jīng)元分化的作用因子RT-PCR在lmx1a、 foxA、pitx3下調(diào)后表達(dá)量降低；與此相反,en1/2和ebf2的表達(dá)量Zdhhc15b在下調(diào)前后沒有顯著變化。提示Zdhhc15b特異性調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)Zdhhc15b元分化過程。進(jìn)一步用技術(shù)篩選與多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育分化相關(guān)信號通RT-PCR路發(fā)現(xiàn),和Shh (SonicHedgehog)信號通路交互作用于W nt/β-cateninZdhhc15b調(diào)節(jié)的多巴胺能神經(jīng)元分化過程。提示Zdhhcl5b可能通過Shh(SonicHedgehog)和Wnt/β-catenin信號通路召募相關(guān)的作用因子特異性調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元分化。結(jié)論本課題使用斑馬魚作為模式生物,首次研究了Zdhhcl5b在斑馬魚體內(nèi)的時空表達(dá)模式。結(jié)果顯示,Zdhhcl5b在斑馬魚間腦高表達(dá),并呈現(xiàn)階段特異性。注射嗎啉代寡核苷酸建立Zdhhcl5b下調(diào)模型,發(fā)現(xiàn)Zdhhcl5b下調(diào)導(dǎo)致斑馬魚腹側(cè)間腦區(qū)域成熟的多巴胺能神經(jīng)元減少,從而導(dǎo)致間腦發(fā)育缺陷以及相應(yīng)的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)斑馬魚Zdhhcl5b表達(dá)影響斑馬魚腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元的分化。Zdhhcl5b下調(diào)后foxA2, lmx1a和pitx3表達(dá)量降低。由此得出結(jié)論,Zdhhcl5b可能通過Shh和Wnt/β-catenin信號通路召募一系列的多巴胺能神經(jīng)元分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子影響多巴胺能神經(jīng)元分化。也就是說通過調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的分化,Zdhhcl5b充當(dāng)決定性因素,調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞向成熟多巴胺能神經(jīng)元命運(yùn)的轉(zhuǎn)化。本研究加深了對DHHC蛋白家族在神經(jīng)發(fā)育中功能的理解,同時為多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育的研究,特別是為多巴胺能神經(jīng)元功能障礙引起的疾病(如阿爾茨海默和帕金森氏病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病)的研究和臨床治療提供了新的線索。第二章bupropion于斑馬魚腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元的增殖和保護(hù)作用背景介紹抑郁癥是一種常見的具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率等特點(diǎn)的精神疾病。抑郁癥發(fā)病率近年來有逐漸增高的趨勢,在普通人群中的發(fā)病率男性為5%-12%,女性為10%～25%。抑郁癥已經(jīng)成為威脅人們心身健康的一大隱患。Bupropion是一種氨基酮類新型抗抑郁藥物。隨著對bupropion的深入研究也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其在戒煙、改善酒精依賴、注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactive disorder, ADHD)等疾病方面的治療作用。盡管有這些重要進(jìn)展,其作用機(jī)制尚未完全了解。此外,有研究表明抗抑郁藥可能會通過促進(jìn)神經(jīng)元再生增加神經(jīng)元數(shù)目達(dá)到治療抑郁癥的目的。眾所周知,多巴胺能神經(jīng)元與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān),那么bupropion對多巴胺能神經(jīng)元有什么作用,其機(jī)制是什么是本課題研究的科學(xué)問題。本研究用斑馬魚作為模式生物,建立多巴胺能神經(jīng)元的MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)損傷模型,分別從體內(nèi)、體外兩個方面通過胚胎整封原位雜交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、整封免疫熒光、細(xì)胞免疫組化、行為學(xué)檢測等方法研究了bupropion對斑馬魚多巴胺能神經(jīng)元的作用,并深入探討了其機(jī)制。研究內(nèi)容為了檢測bupropion對多巴胺能神經(jīng)元是否有作用,本課題首先建立了多巴胺能神經(jīng)元的MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPT P)損傷模型。實驗分為對照組、MPTP (5ug/mL)、bupropion (100、300μM)+MPTP組。TH/DAT原位雜交/TH免疫熒光結(jié)果顯示,在斑馬魚腹側(cè)間腦區(qū)域出現(xiàn)TH標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元,MPTP (5μg/mL)處理組的多巴胺能神經(jīng)元與對照比相比明顯減少；而bupropion可以改善MPTP對多巴胺能神經(jīng)元的損傷,bupropion處理后斑馬魚胚胎腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元比損傷組明顯增多并呈濃度依賴型。為了進(jìn)一步確認(rèn)bupropion對多巴胺能神經(jīng)元的作用,取斑馬魚間腦進(jìn)行了多巴胺能神經(jīng)元的體外培養(yǎng)。實驗分為對照組、MPP+(10μM)、bupropion+MPP+C 75μM),TH免疫熒光檢測多巴胺能神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果顯示bupropion可以改善MPP+對多巴胺能神經(jīng)元的損傷,bupropion處理組TH陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目比MPP+組明顯增多,結(jié)果與體內(nèi)實驗一致。為了進(jìn)一步檢鋇bupropion對多巴胺能神經(jīng)元功能的影響本課題進(jìn)行了T迷宮實驗,結(jié)果表明bupropion可以改善MPTP引起的斑馬魚認(rèn)知功能障礙。以上結(jié)果提示bupropion對斑馬魚間腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育過程起到重要作用。鑒于bupropion處理后TH+/DAT+神經(jīng)元的數(shù)目的增加,這促使本文檢測定bupropion對多巴胺能神經(jīng)元是否有保護(hù)作用。為此,在斑馬魚胚胎發(fā)育24hpf和48hpf時期進(jìn)行吖啶橙染色實驗。結(jié)果顯示,與對照組相比,MPTP損傷組的多巴胺能神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多,而bupropion處理組的多巴胺能神經(jīng)元的凋亡數(shù)目比MPTP損傷組明顯減少。提示bupropion對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物對抑郁癥的治療都需要比較長的療程,有人提出抗抑郁藥物可能通過促進(jìn)神經(jīng)元增殖達(dá)到神經(jīng)元數(shù)目增加的效果,從而達(dá)到治療的目的。為了檢測bupropion對多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)生成作用,首先開展了PCNA原位雜交和BrdU摻入實驗,結(jié)果表明斑bupropion處理組多巴胺能神經(jīng)元存在的PT(posteriortuberculum, PT)區(qū)域處于增殖狀態(tài)的神經(jīng)元明顯多于MPTP損傷組。提示bupropion對多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖有重要作用。Ngn1是多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,ngnl原位雜交結(jié)果顯示,bupropion處理組的ngnl表達(dá)量比MPTP損傷組明顯增強(qiáng)。為了進(jìn)一步證明bupropion的神經(jīng)生成作用,當(dāng)斑馬魚發(fā)育至16-18hp耐取多巴胺前體神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng),ngnl免疫熒光結(jié)果顯示bupropion處理組與MPP+組相比,處于增殖狀態(tài)的多巴胺前體神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,與體內(nèi)實驗結(jié)果一致。以上結(jié)果提示,bupropion在多巴胺前體神經(jīng)元增殖過程中發(fā)揮重要作用。與多巴胺能神經(jīng)元再生和前期誘導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子篩選發(fā)現(xiàn),bupropion處理組的enl、en2的表達(dá)量比MPTP組明顯升高,推測bupropion可能通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的增殖再生,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。結(jié)論抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物主要治療機(jī)制目前還不清楚,而且由于缺乏人類臨床研究,這是目前面臨的一個重大科學(xué)問題。本研究發(fā)現(xiàn)bupropion具有保護(hù)和促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元再生的作用,這將深化人們對bupropion作為抗抑郁藥物的治療機(jī)制的認(rèn)識。同時,bupropion對多巴胺能神經(jīng)元的再生可能為抑郁癥或相關(guān)精神疾病的治療提供新的靶標(biāo)。此外,對參與多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的細(xì)胞及分子機(jī)制的全面了解,將大大推動對抑郁癥的治療和多巴胺能神經(jīng)元功能障礙引起的其他精神疾病的藥物治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R338
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本文編號：1890201