本文選題：新中東呼吸綜合征冠狀病毒 + 受體結(jié)合區(qū)��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：新中東呼吸綜合癥(MERS)冠狀病毒(MERS-CoV)于2012年在沙特地區(qū)首次發(fā)現(xiàn),隨后,在全世界范圍內(nèi)傳播,嚴(yán)重威脅人類健康。MERS病毒感染已經(jīng)在27個(gè)國家地區(qū)出現(xiàn),感染及死亡病例持續(xù)增加。截止2017年3月8日,世界衛(wèi)生組織報(bào)告的感染病例死亡病例分別為1917例和677例,病死率高于35%。針對MERS-CoV疫苗研究已廣泛開展,目前,多種候選疫苗處于臨床前研究階段,尚無人用MERS疫苗上市。以MERS-CoV刺突糖蛋白(Spike protein,S)受體結(jié)合區(qū)(Receptor Binding Domain,RBD)為抗原靶點(diǎn)的亞單位疫苗研究不斷深入,為MERS-CoV蛋白關(guān)鍵免疫保護(hù)功能區(qū)。前期研究中,針對免疫有效功能區(qū)段的優(yōu)化,免疫方案確定及免疫保護(hù)特性等方面進(jìn)行了深入的研究。但對于MERS-CoV RBD疫苗的免疫機(jī)制研究,仍存在一些問題需解答,例如,自2012年首次發(fā)現(xiàn)以來,經(jīng)歷5年的流行及傳播,毒株出現(xiàn)多種突變,MERS-CoV RBD區(qū)段的突變是否會(huì)引起免疫保護(hù)能力下降,而導(dǎo)致該區(qū)段不再適合作為疫苗研究靶點(diǎn)?是否可以通過模擬MERS-CoV RBD蛋白的天然構(gòu)象形式,設(shè)計(jì)MERS-CoV RBD構(gòu)象優(yōu)化疫苗,提高免疫保護(hù)效果?MERS-CoV RBD區(qū)所含免疫功能表位在其誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答中的作用如何,可否對其進(jìn)行精確評價(jià)?可否通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化,對MERS-CoV RBD非中和免疫優(yōu)勢表位進(jìn)行封閉,促進(jìn)中和性免疫應(yīng)答反應(yīng),使其對MERS-CoV產(chǎn)生完全免疫保護(hù)?為了回答以上問題,我們設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn),對MERS-CoV RBD蛋白進(jìn)行了深入研究,進(jìn)一步多角度闡明其免疫保護(hù)機(jī)制。1.MERS-CoV蛋白受體結(jié)合功能區(qū)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用特征研究依據(jù)2012-2015年間,所有不同地區(qū),不同宿主來源的MERS-CoV流行株MERS-CoV RBD區(qū)突變情況,利用定點(diǎn)突變的方法,在EMC-RBD基礎(chǔ)上,構(gòu)建5種RBD疫苗株:2012-RBD,2013-RBD,2014-RBD,2015-RBD及Camel-RBD,分別包含2012-2015年度,人源及駱駝源流行代表病毒株RBD區(qū)單個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn),同時(shí)構(gòu)建表達(dá)MERS病毒S蛋白基因的真核載體,用于包裝17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來源的MERS-CoV假病毒,以及5株單克隆抗體逃逸假病毒株。利用真核蛋白表達(dá)系統(tǒng),成功在293T細(xì)胞中,表達(dá)該5種MERS-CoV RBD蛋白,并成功包裝22株高滴度MERS-CoV假病毒,用于免疫血清交叉中和效果評價(jià)。利用免疫共沉淀法,酶聯(lián)免疫吸附法和細(xì)胞流式法鑒定RBD蛋白與MERS-CoV受體DPP4的結(jié)合能力,結(jié)果表明,MERS-CoV RBD突變蛋白能夠有效地結(jié)合人源及駱駝來源的DPP4蛋白,且前者強(qiáng)于后者;利用酶聯(lián)免疫吸附法測定MERS-CoV RBD蛋白與4種中和性單克隆抗體(鼠源單抗:Mersmab1,人源單抗:m336,m337和m338)的結(jié)合,結(jié)果與EMC-RBD蛋白無顯著差異,具有良好的抗原性;MERS-CoV RBD蛋白免疫小鼠血清,能夠誘導(dǎo)高水平特異性抗體產(chǎn)生,且對17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來源的MERS假病毒,5株單克隆抗體逃逸假病毒株,及2株活病毒具有強(qiáng)的交中和反應(yīng)。同時(shí)設(shè)計(jì)2種包含MERS-CoV受體結(jié)合域(RBM)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的RBD蛋白:RBD-FGG和RBD-FGGAA,其功能性,抗原性及所誘導(dǎo)的交叉性中和抗體均有顯著減弱,然而,這種免疫逃逸是在MERS-CoV毒力及傳播流行能力下降甚至消失的情況下發(fā)生,自然情況下,該流行株不能存在,進(jìn)一步證實(shí)了RBD作為亞單位疫苗靶點(diǎn)的可行性。因此,本部分研究證明MERS-CoV RBD作為重要的亞單位疫苗靶點(diǎn)能夠誘導(dǎo)高效廣譜的交叉保護(hù)性免疫,對人及駱駝來源的MERS-CoV流行株有交叉中和作用,為研發(fā)安全高效廣譜RBD疫苗提供重要的理論基礎(chǔ)。2.類天然構(gòu)象性三聚體MERS-CoV RBD重組蛋白免疫保護(hù)作用研究基于第一部分研究結(jié)果,位于S蛋白內(nèi)的RBD區(qū)可作為廣譜疫苗研究的有效靶點(diǎn),如何在此基礎(chǔ)上提高免疫保護(hù)效果,闡明構(gòu)象性蛋白免疫保護(hù)功能區(qū)設(shè)計(jì)機(jī)制,成為下一個(gè)研究重點(diǎn)。MERS-CoV S蛋白在病毒表面形成天然三聚體結(jié)構(gòu),本部分研究擬對RBD蛋白進(jìn)行構(gòu)象性優(yōu)化與設(shè)計(jì),通過重組融合三聚體形成單位,即Foldon序列,重組表達(dá)MERS-CoV RBD-Fd蛋白。以期通過形成三聚體蛋白,模擬病毒表面RBD蛋白天然構(gòu)象,繼而被開發(fā)成既能發(fā)揮免疫保護(hù)功能的疫苗候選蛋白,又能有效阻斷病毒感染的治療性蛋白藥物。結(jié)果表明:首先,成功在真核系統(tǒng)表達(dá)出具有三聚體構(gòu)象的MERS-CoV RBD-Fd蛋白,且能夠與MERS病毒受體DPP4高效結(jié)合,能夠有效阻斷MERS假病毒感染MERS病毒敏感細(xì)胞系。其次,動(dòng)物免疫及血清學(xué)檢驗(yàn)表明,RBD-Fd蛋白能夠有效誘導(dǎo)高滴度的中和抗體的產(chǎn)生,且能夠維持長期保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。對人DPP4轉(zhuǎn)基因小鼠的活病毒攻毒試驗(yàn)產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。本部分研究重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)在以包膜糖蛋白為靶點(diǎn)的亞單位疫苗設(shè)計(jì)中天然構(gòu)象性抗原的作用,證明了基于免疫原天然構(gòu)象的疫苗設(shè)計(jì)應(yīng)用于MERS-CoV RBD亞單位疫苗的可行性。為研發(fā)RBD為基礎(chǔ)的MERS預(yù)防及治療性藥物奠定基礎(chǔ)。3.MERS-CoV病毒RBD關(guān)鍵位點(diǎn)糖基化修飾對免疫保護(hù)作用影響和機(jī)制研究本部分研究通過闡明特定表位在MERS-CoV RBD蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和保護(hù)免疫所發(fā)揮的作用,鑒定非中和表位及免疫優(yōu)勢表位,進(jìn)一步揭示MERS-CoV RBD疫苗免疫保護(hù)機(jī)制并指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗及其他病毒性亞單位疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)。基于第一部分和第二部分研究結(jié)果,證實(shí)RBD存在特定表位的改變所引發(fā)的免疫應(yīng)答發(fā)生變化,而基于結(jié)構(gòu)構(gòu)象的疫苗設(shè)計(jì)可以應(yīng)用于RBD蛋白分子。根據(jù)MERS-CoV RBD蛋白晶體結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn),選取4個(gè)在MERS-CoV RBD不同的獨(dú)立表位:Arg511、Ala562、Val403和Thr579。利用定點(diǎn)突變PCR方法在相應(yīng)位點(diǎn)形成N糖基化基序,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中,分別表達(dá)并純化4種突變MERS-CoV RBD蛋白。利用SDS-PAGE和質(zhì)譜分析的方法鑒定了糖基化的形成。利用AlphaScreen法和流式細(xì)胞法分析重組MERS-CoV RBD蛋白與人DPP4蛋白間的結(jié)合能力結(jié)果顯示,位于511位置的糖基化修飾可阻斷RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。位于562位置的糖基化修飾可降低MERS-CoV RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。而位于403和579位的糖基化則對RBD與DPP4之間的結(jié)合沒有影響。實(shí)驗(yàn)也分析了糖基化位點(diǎn)的引入對MERS-CoV RBD蛋白抗原性變化(hMS-1,m336-Fab,m337-Fab和m338-Fab)。ELISA結(jié)果顯示,位于511位的糖基化突變完全阻斷了RBD蛋白與Mersmab1的結(jié)合,降低了MERS-CoV RBD蛋白對m336-Fab和m337-Fab的結(jié)合。與511位不同,403,562和579位糖基化對MERS-CoV RBD蛋白與任意4種中和性單克隆抗體結(jié)合均無顯著影響。免疫原性及中和抗體分析顯示,與MERS-CoV RBD野生型蛋白相比,分別帶有579和511位糖基化表位的MERS-CoV RBD蛋白,前者能夠顯著提高中和抗體滴度,而后者的中和抗體滴度則顯著降低。而分別帶有403和562位點(diǎn)糖基化的MERS-CoV RBD蛋白所誘導(dǎo)的中和抗體滴度與野生型相比則沒有顯著性差別,同時(shí),在活病毒保護(hù)性評價(jià)中,得到相似結(jié)果。為定量地評價(jià)表位的中和免疫原性,我們提出一個(gè)新的“中和免疫原性指數(shù)”(NII)的概念,并定義其為,在某特定表位中,糖基化探針的出現(xiàn)或消失對免疫原誘導(dǎo)中和免疫效應(yīng)能力的改變的比值。NII可以作為一個(gè)有效的評價(jià)手段定量地評價(jià)MERS-CoV RBD疫苗上特定表位,進(jìn)一步闡明免疫保護(hù)機(jī)制,從而指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)。總之,我們的研究在鑒定了MERS-CoV RBD蛋白誘導(dǎo)廣譜交叉性中和保護(hù)效果的基礎(chǔ)上,通過對RBD分子構(gòu)象性改造,及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的RBD分子修飾提高RBD亞單位疫苗的保護(hù)效果,對以結(jié)構(gòu)蛋白為靶點(diǎn)的抗病毒疫苗優(yōu)化設(shè)計(jì)提供重要評價(jià)方法,進(jìn)一步揭示了MERS-CoV關(guān)鍵免疫保護(hù)功能區(qū)的免疫保護(hù)作用機(jī)制。
[Abstract]:The MERS - CoV RBD has been extensively studied in 27 countries . In this study , we have conducted an in - depth study on the immune mechanism of MERS - CoV RBD . The results showed that MERS - CoV RBD can induce high - level specific antibody production . The results showed that MERS - CoV RBD protein could induce high - level specific antibody production . The results showed that MERS - CoV RBD was used as important subunit vaccine target to induce high - level specific antibody production , and it was proved that MERS - CoV RBD was used as important subunit vaccine target to induce high - level specific antibody production . Based on the results of the first part and the second part , it is proved that the RBD - FBD protein can effectively induce the generation of high titer neutralizing antibody and can effectively block the immune response reaction of MERS - CoV RBD . The results of ELISA showed that the glycosylation mutation at 511 site completely blocked the binding of RBD protein to Mersmab1 , and reduced the binding of MERS - CoV RBD protein to m336 - Fab and m337 - Fab .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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1 陳潔;陳e，

本文編號(hào)：1813005