本文選題：胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌 + RNA-seq技術(shù)　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一種具有高度接觸性的豬呼吸道傳染病,給全世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)是巴斯德菌科放線(xiàn)桿菌屬的一種革蘭氏陰性小桿菌。APP基因組序列的注釋工作是通過(guò)基于基因預(yù)測(cè)、計(jì)算機(jī)算法等生物信息學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于計(jì)算機(jī)方法在原核生物基因注釋方面固有的局限性,目前對(duì)APP基因組的注釋遠(yuǎn)未完成。應(yīng)用高通量RNA-seq技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組分析,能夠準(zhǔn)確有效的發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)區(qū)和未知的轉(zhuǎn)錄單位,尤其能夠用于sRNA、UTR和調(diào)節(jié)功能元件的鑒定。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者和功能載體,通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用行使復(fù)雜的生物功能,參與了生物體內(nèi)幾乎所有的生物過(guò)程。研究蛋白質(zhì)的相互作用有助于理解生物體尤其是致病菌各項(xiàng)生命活動(dòng)的機(jī)理,并能為抗菌藥物提供新的靶標(biāo)。目前,APP蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)非常匱乏,這極大的限制了對(duì)APP的基因功能、調(diào)控機(jī)理、致病機(jī)制和藥靶篩選等研究。本研究一方面采用RNA-seq技術(shù)對(duì)APP進(jìn)行了全面的轉(zhuǎn)錄組分析,對(duì)現(xiàn)有的基因組注釋進(jìn)行了完善,并對(duì)APP的基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)單元進(jìn)行了詳細(xì)的分析鑒定。另一方面,采用同源映射的方法構(gòu)建了APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),并挖掘了未知蛋白的功能,揭示了新的蛋白質(zhì)相互作用,從蛋白組水平分析了APP的信號(hào)調(diào)控機(jī)制,預(yù)測(cè)了潛在藥物靶標(biāo)。取得的主要研究結(jié)果如下:1.APP單堿基分辨率轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建與分析通過(guò)對(duì)RNA-seq獲得的reads的質(zhì)量評(píng)估與APP基因組匹配并統(tǒng)計(jì)分析,匹配到基因組的reads數(shù)為38,568,297,reads的長(zhǎng)度為90bp,得到的總堿基數(shù)為3,723,758,460,得到樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)大小為3.5Gb,相當(dāng)于基因組覆蓋深度的1700倍,表明本研究所獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的質(zhì)量和分辨率,能夠很好地反應(yīng)APP基因組的轉(zhuǎn)錄狀況,并能對(duì)低豐度的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行鑒定,進(jìn)而成功繪制了APP全基因組水平的單堿基分辨率轉(zhuǎn)錄圖譜。鑒定出APP基因組注釋2147個(gè)基因中共有1933個(gè)基因是轉(zhuǎn)錄的,并對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的RPKM計(jì)算。對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了cog分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的基因分布在所有的cog功能分類(lèi)中。同時(shí)鑒定出2325個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因間區(qū)區(qū)域。依據(jù)rna-seq數(shù)據(jù),對(duì)原有的app基因組注釋進(jìn)行了優(yōu)化。在app中共鑒定出32個(gè)新基因,最短的編碼26個(gè)氨基酸,最長(zhǎng)的編碼90個(gè)氨基酸,平均大小約為47個(gè)氨基酸。通過(guò)轉(zhuǎn)錄圖譜對(duì)現(xiàn)有基因組注釋的35個(gè)基因的起始位置進(jìn)行了矯正。通過(guò)rna-seq數(shù)據(jù)共預(yù)測(cè)出1946個(gè)utr。其中847個(gè)utr位于app操縱子內(nèi)部,無(wú)法明顯區(qū)分utr的邊界。其余1099個(gè)utr位于app操縱子外部。對(duì)找到的具有5’-utr和3’-utr相應(yīng)的基因進(jìn)行cog功能分析,并分析了不同cog功能分類(lèi)基因的utr長(zhǎng)度分布�？梢园l(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的utr最長(zhǎng),而dna復(fù)制、重組、修復(fù),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的utr較短。篩選出app中的51個(gè)候選srna,通過(guò)將鑒定出的所有候選srna序列,比對(duì)rfam數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定出11個(gè)在其他物種中保守的、有明確注釋功能的srna。鑒定出由840個(gè)共表達(dá)基因?qū)?共1230個(gè)基因)組成的351個(gè)獨(dú)立的操縱子,并通過(guò)rt-pcr對(duì)其中隨機(jī)選取的26個(gè)操縱子的40對(duì)共表達(dá)基因?qū)M(jìn)行了驗(yàn)證。上述研究結(jié)果不僅證實(shí)了app注釋基因的轉(zhuǎn)錄情況,對(duì)原基因組注釋進(jìn)行了矯正,使得當(dāng)前的基因組注釋更加完善準(zhǔn)確,并且發(fā)現(xiàn)了較多新的功能元件(例如新的蛋白,非編碼srna,操縱子結(jié)構(gòu)),為該病原菌基因功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)理和致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。2.app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析基于同源蛋白映射的方法,利用app基因組全部的蛋白質(zhì)編碼信息,以及從數(shù)據(jù)庫(kù)下載的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),構(gòu)建了app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。互作網(wǎng)絡(luò)共包括2737對(duì)非冗余蛋白質(zhì)互作對(duì),共涉及553個(gè)蛋白質(zhì)。所包含的蛋白分布在所有的cog功能分類(lèi)中,極顯著富集的cog功能類(lèi)為j類(lèi)(翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)、生物合成)、e類(lèi)(氨基酸的運(yùn)輸與代謝)和s類(lèi)(功能未知的蛋白質(zhì))。利用cytoscape軟件對(duì)app蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與屬性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)具有小世界性和無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì),這樣的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)具有良好的容錯(cuò)性和穩(wěn)定性,而且信息傳遞速度快,可以對(duì)外界壓力變化迅速作出響應(yīng),能夠在環(huán)境突發(fā)壓力下展現(xiàn)出較高的耐受力。構(gòu)建了hns蛋白質(zhì)的互作子網(wǎng)絡(luò),并對(duì)其包含的所有16對(duì)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系通過(guò)細(xì)菌雙雜交的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,證實(shí)本研究構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)的可靠性。通過(guò)APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中與假設(shè)蛋白存在互作關(guān)系的功能已知的蛋白質(zhì)對(duì)23個(gè)假設(shè)蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)。APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中有131個(gè)蛋白質(zhì)存在于KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中全部32條生物通路中,生物通路中復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系使得APP生物途徑中的少數(shù)蛋白質(zhì),當(dāng)在外界壓力下表達(dá)受到抑制,生物途徑并不會(huì)終止,而是可以通過(guò)其他替代蛋白質(zhì)行使功能繼續(xù)完成該生物途徑。進(jìn)一步構(gòu)建由胞壁合成與嘧啶代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)互作子網(wǎng)絡(luò),進(jìn)行APP中藥物靶標(biāo)的預(yù)測(cè)。從全局角度結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和參考文獻(xiàn),確定已知藥物靶標(biāo)22個(gè),有文獻(xiàn)報(bào)道的潛在藥物靶標(biāo)13個(gè),新的候選藥物靶標(biāo)18個(gè)。對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)類(lèi)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)也做了進(jìn)一步分析。APP全基因組中,參與機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白共有38個(gè),在本研究所構(gòu)建的APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中參與信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白共有15個(gè),相互作用的比例為39.5%。構(gòu)建了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)蛋白質(zhì)互作子網(wǎng)絡(luò),并對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)蛋白和轉(zhuǎn)錄類(lèi)蛋白通過(guò)相互作用所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)APP中存在T類(lèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和K類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的相互作用,例如Crp蛋白與RpoA、RpoD和PurR蛋白互作,共同調(diào)控下游基因的表達(dá)。說(shuō)明APP中存在復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控模式。這些研究結(jié)果預(yù)測(cè)了新的APP蛋白質(zhì)功能,從蛋白組水平初步揭示了APP的代謝網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)傳導(dǎo)模式,為APP基因功能、信號(hào)交流與基因調(diào)控、環(huán)境適應(yīng)與致病機(jī)理的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
[Abstract]:On the one hand , the genetic function , regulation mechanism , pathogenic mechanism and target screening of APP have been analyzed by using high - throughput RNA - seq technology .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
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本文編號(hào)：1771748