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  本文關(guān)鍵詞：高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學(xué)》 2015年

高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析

葉露鵬  

【摘要】：家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表,作為第二大模式昆蟲,它不僅有著重要的研究價(jià)值,而且可以帶來可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功建立是生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑,它頻繁的被用于改變生物的性狀以及通過這種技術(shù)在生物體中表達(dá)一些珍貴的外源蛋白。PiggyBac轉(zhuǎn)座子是最具吸引力的轉(zhuǎn)座原件之一,它已經(jīng)廣泛的被應(yīng)用于十多種生物的研究。PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為家蠶的轉(zhuǎn)基因研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。家蠶絲腺有著驚人的蛋白合成和分泌的能力,是一種非常理想的生物反應(yīng)器。經(jīng)過數(shù)十年的努力,研究人員已經(jīng)創(chuàng)建了家蠶中部和后部絲腺生物反應(yīng)器。這些生物反應(yīng)器已經(jīng)成功表達(dá)了數(shù)十種外源蛋白。然而,現(xiàn)有的家蠶絲腺生物反應(yīng)器效率依舊不高,主要體現(xiàn)在piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率低、外源蛋白表達(dá)量較低、以及理想的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體篩選較復(fù)雜等等,這幾個(gè)問題成為了建立高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器所面臨的最大障礙。因此,提高轉(zhuǎn)基因效率、提高外源基因表達(dá)量以及創(chuàng)建一種快速外源基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體篩選方法顯得尤為重要。本文就針對(duì)這些科學(xué)問題展開了一系列的研究,取得的主要成果歸納如下：1、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)piggyBac轉(zhuǎn)座子的高效轉(zhuǎn)座針對(duì)piggyBac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率不高這個(gè)問題,本研究創(chuàng)建了一種有效提高轉(zhuǎn)座效率的新方法,該方法的核心是構(gòu)建一個(gè)類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白(transcription activator-like effector, TALE)和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)的融合蛋白(TALE-PBase)。實(shí)驗(yàn)證明TALE-PBase融合蛋白可以顯著地將轉(zhuǎn)座效率提高到63.9%,這相當(dāng)于是目前轉(zhuǎn)座效率平均水平的7倍。而且新方法的轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)中的陽性個(gè)體數(shù)每區(qū)平均達(dá)到近18條,比目前家蠶轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的平均水平最大提高了5.7倍。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅提高了轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)數(shù),而且也明顯提高了陽性蛾區(qū)中的陽性個(gè)體數(shù)。這兩方面的提高是piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的巨大突破,為今后的轉(zhuǎn)基因研究提供了很好的技術(shù)支撐。2、家蠶絲膠1啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與活性分析啟動(dòng)子是調(diào)控目的基因時(shí)空表達(dá)重要的調(diào)控原件之一。然而,絕大多數(shù)的研究將目光放在了核心啟動(dòng)子或近端啟動(dòng)子區(qū)域,而近端啟動(dòng)子5’端的序列常常被人們所忽視。本研究就4kb長度的家蠶絲膠1 (sericin 1, Serl)啟動(dòng)子序列通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到種類眾多的潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),采用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)越多且種類越豐富時(shí),啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性就越強(qiáng)大。但是重復(fù)的近端啟動(dòng)子多個(gè)拷貝組合并不能提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平,而且重復(fù)的近端啟動(dòng)子拷貝數(shù)越多,下游基因的轉(zhuǎn)錄水平反而越低。結(jié)果說明,4 kb長度的Serl啟動(dòng)子要比其短的啟動(dòng)子活性要高,重復(fù)的近端啟動(dòng)子多個(gè)拷貝組合并不能提高下游基因轉(zhuǎn)錄活性。這個(gè)結(jié)果為今后構(gòu)建高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器時(shí)選擇合適長度的啟動(dòng)子提供了參考。3、PiggyBac轉(zhuǎn)座子在家蠶基因中的定向轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)轉(zhuǎn)座時(shí)常不利于外源基因的表達(dá),而且可能會(huì)引起內(nèi)源基因的突變。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座理論上有可能實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。PBase通過TALE靶向蛋白的牽引到達(dá)目的位點(diǎn),從而在目的位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。通過研究我們發(fā)現(xiàn)了TALE-PBase介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座改變了piggyBac轉(zhuǎn)座子原先完全隨機(jī)插入的特性,而是變的更加具有傾向性,但還沒有得到真正定向轉(zhuǎn)座的結(jié)果。我們還在71個(gè)轉(zhuǎn)座家蠶中發(fā)現(xiàn)了2對(duì)插入位點(diǎn)一樣的家蠶,這種現(xiàn)象在常規(guī)的piggyBac轉(zhuǎn)座研究中是非常罕見的。由此可見,TALE對(duì)PBase在一定程度上起到了靶向引導(dǎo)作用,這為今后在個(gè)體水平實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)座提供了寶貴的參考價(jià)值。4、TALEN介導(dǎo)的家蠶同源重組家蠶受精卵相當(dāng)于家蠶的早期個(gè)體,相比細(xì)胞,它更能反應(yīng)生命的真實(shí)情況。因此,用家蠶受精卵進(jìn)行同源重組(homologous recombination, HR)實(shí)驗(yàn)可以反應(yīng)個(gè)體水平同源重組的發(fā)生概率。同源重組精確的基因組編輯能力可以彌補(bǔ)其它基因組打靶技術(shù)的不足,而且也可以解決piggyBac轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組這一問題。但同源重組的低效率現(xiàn)象是阻礙其廣泛應(yīng)用的一個(gè)限制因素。本研究采用蠶卵為材料,將TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒注射到產(chǎn)卵8h的家蠶受精卵內(nèi),經(jīng)72 h后進(jìn)行TALEN打靶效率的鑒定以及同源重組效率的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TALEN在顯微注射后72 h就已經(jīng)對(duì)靶位點(diǎn)產(chǎn)生了明顯突變,在檢測(cè)的15組樣品中有12組出現(xiàn)了明顯打靶,打靶效率達(dá)到80%。并且在15組受精卵中成功檢測(cè)到3組包含陽性的同源重組個(gè)體,同源重組效率達(dá)到20%。這種蠶卵早期的TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測(cè)可以在短期內(nèi)評(píng)判實(shí)驗(yàn)的可行性,為后續(xù)陽性同源重組個(gè)體的篩選提供保障。同時(shí)也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒組合可以實(shí)現(xiàn)精確的基因組編輯。5、外源基因表達(dá)效率的輔助檢測(cè)雖然piggyBac轉(zhuǎn)座子是以隨機(jī)的方式插入基因組,但是將外源基因表達(dá)框和標(biāo)志基因表達(dá)框以相同轉(zhuǎn)錄方向緊密的構(gòu)建在一起時(shí),我們相信即使在不同的插入位點(diǎn),兩個(gè)表達(dá)框受到來自基因組的影響是相近的。我們構(gòu)建了螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FLuc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)兩個(gè)相鄰的基因,作了轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)分析,結(jié)果表明即使插入位點(diǎn)不同,這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平總是顯著相關(guān)的。ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示EGFP的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平同樣也是顯著相關(guān)。所以,外源基因的表達(dá)水平可以通過檢測(cè)標(biāo)志基因(EGFP)的表達(dá)水平來簡單的預(yù)測(cè)。綜上所述,本論文從提高轉(zhuǎn)基因效率、提高外源基因的表達(dá)效率以及建立外源基因表達(dá)效率的輔助檢測(cè)方法這3個(gè)層次來優(yōu)化家蠶絲腺生物反應(yīng)器并取得了相應(yīng)的成果,為最終建立高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測(cè)可以在短期內(nèi)評(píng)判實(shí)驗(yàn)的可行性,為后續(xù)陽性同源重組個(gè)體的篩選提供保障。同時(shí)也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒組合可以實(shí)現(xiàn)精確的基因組編輯。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;S881.2
【目錄】：

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10 程洛單;鄒曙明;田玉梅;杜雪地;;金魚hAT家族Tgf2轉(zhuǎn)座子在斑馬魚胚胎中的自我剪切[A];2012年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2012年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馮衛(wèi)東;[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

2 本報(bào)記者 馮衛(wèi)東;[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

3 樸淑瑜;[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉露鵬;高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析[D];浙江大學(xué);2015年

2 劉東;多倍體魚轉(zhuǎn)座子的遺傳變異和雌核發(fā)育魚性腺發(fā)育的分子生物學(xué)研究[D];湖南師范大學(xué);2009年

3 張化浩;家蠶基因組中轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移[D];重慶大學(xué);2014年

4 陳勇;全基因組中網(wǎng)絡(luò)缺失基因和微型轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)及研究[D];山東大學(xué);2008年

5 馬赑;桑樹全基因組轉(zhuǎn)座子的鑒定及特征分析[D];西南大學(xué);2014年

6 丁昇;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

7 王娜;基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶定向遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];浙江大學(xué);2010年

8 吳敏;鱗翅目昆蟲中piggyBac轉(zhuǎn)座子研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 胡廣東;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的改造及其介導(dǎo)的牛核移植轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞生產(chǎn)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

10 韓民錦;家蠶MITE轉(zhuǎn)座子的鑒定、進(jìn)化和功能以及家蠶轉(zhuǎn)座子的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)研究[D];西南大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高杰;家蠶內(nèi)源性piRNA促進(jìn)家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性[D];西南大學(xué);2015年

2 楊晶晶;組織培養(yǎng)誘導(dǎo)下水稻met1-2突變體反轉(zhuǎn)座子Tos17活性與組蛋白修飾關(guān)系研究[D];東北師范大學(xué);2015年

3 周家慶;不同轉(zhuǎn)座子在豬和鼠胎兒成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)座活性的比較研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

4 謝雨琇;多轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和胚胎中轉(zhuǎn)座活性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

5 劉玉博;利用轉(zhuǎn)座子插入突變篩選高效產(chǎn)油菌株[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 張陸;豬源多重耐藥大腸桿菌轉(zhuǎn)座子的流行及其接合共轉(zhuǎn)移分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 鄧平;深紅紅螺菌高產(chǎn)氫突變株的篩選及轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)分析[D];西南大學(xué);2008年

8 唐江濤;細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5gusA5在野油菜黃單胞菌8004中轉(zhuǎn)座規(guī)律分析及生物學(xué)驗(yàn)證[D];廣西大學(xué);2003年

9 謝飛;“睡美人”轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)對(duì)于外源基因整合和表達(dá)促進(jìn)作用[D];揚(yáng)州大學(xué);2008年

10 何姍;表達(dá)豬端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞永生化中的應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：176865