本文選題：低pH脅迫　切入點(diǎn)：Al脅迫　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：土壤酸化被認(rèn)為是植物生長(zhǎng)的重要限制因子。全世界40%以上的土壤屬于酸性土壤。低p H和鋁(Al)毒害被認(rèn)為是酸性土壤中兩個(gè)主要的障礙因子,二者對(duì)植物的毒害特征均是抑制根的伸長(zhǎng)。但是,植物響應(yīng)低p H和Al脅迫的過程中,是否存在相同或不同的生理生化、分子生物學(xué)機(jī)制,目前尚不清楚。本研究采用Tandem Mass Tag(TMT)技術(shù)對(duì)低p H和Al分別處理的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量比較,篩選、鑒定低p H及Al響應(yīng)蛋白,并對(duì)兩者之間的脅迫響應(yīng)蛋白進(jìn)行分析;本實(shí)驗(yàn)又同時(shí)通過克隆和轉(zhuǎn)化的方法,將擬南芥基因組中部分轉(zhuǎn)錄因子和泛素化連接酶基因在擬南芥中過表達(dá),檢測(cè)編碼蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)是否受Al誘導(dǎo);最后,對(duì)At2G39100(L4975)基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下。1.低p H和Al脅迫下擬南芥根蛋白質(zhì)組比較分析利用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較低p H和Al脅迫的擬南芥根蛋白質(zhì)組。處理24 h后,鑒定到345個(gè)低p H脅迫響應(yīng)蛋白,其中231個(gè)上調(diào),114個(gè)下調(diào),鑒定到509個(gè)Al脅迫響應(yīng)蛋白,其中382個(gè)上調(diào),127個(gè)下調(diào)。同時(shí)響應(yīng)低p H和Al脅迫的蛋白有196個(gè)。單獨(dú)響應(yīng)低p H脅迫的蛋白有149個(gè),單獨(dú)響應(yīng)Al脅迫的蛋白有313個(gè)。脅迫響應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)分析表明,根中脅迫響應(yīng)蛋白受轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后機(jī)制的調(diào)控。生物信息學(xué)分析表明,低p H脅迫響應(yīng)蛋白富集于58個(gè)KEGG代謝通路,Al脅迫響應(yīng)蛋白富集于66個(gè)KEGG代謝通路。對(duì)低p H和Al脅迫響應(yīng)蛋白的GO注釋及KEGG信號(hào)通路比較分析發(fā)現(xiàn),低p H和Al脅迫均可激活細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、蛋白代謝、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、抗氧化系統(tǒng)及DNA修復(fù)系統(tǒng)等途徑。Al脅迫后,細(xì)胞壁和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)受到嚴(yán)重抑制,而低p H脅迫后細(xì)胞壁和細(xì)胞骨架蛋白量變化相對(duì)較小。蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶是Al脅迫途徑中的主要信號(hào)分子,而低p H脅迫后幾乎沒有激酶和磷酸酶的響應(yīng),說明蛋白激酶/磷酸酶可能不是擬南芥響應(yīng)低p H脅迫的主要信號(hào)分子。綜上,我們對(duì)低p H和Al脅迫之間的分子水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有了初步認(rèn)識(shí),且發(fā)現(xiàn)了其調(diào)控的相關(guān)性以及獨(dú)立性。2.部分轉(zhuǎn)錄因子和E3泛素連接酶基因的克隆轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證通過In-fusion技術(shù),從擬南芥Columbia 4(Col 4)中克隆到60個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和40個(gè)泛素連接酶基因,并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體p EGAD-LUC,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL0,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花浸染方法轉(zhuǎn)化擬南芥Col 4,并通過Basta抗性篩選、LUC標(biāo)簽檢測(cè)和基因組鑒定得到T3代轉(zhuǎn)基因陽性苗152株。3.轉(zhuǎn)基因擬南芥中Al響應(yīng)蛋白的篩選及表型分析25μM Al處理327個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白和420個(gè)泛素連接酶蛋白對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因材料,通過Luminometer儀檢測(cè)12 h內(nèi)蛋白的表達(dá)量。其中,14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)≥1.5,且P值≤0.01,其中,6個(gè)相對(duì)表達(dá)量升高,8個(gè)相對(duì)表達(dá)量降低。泛素連接酶蛋白中,共有18個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)≥1.5并且P值≤0.01,14個(gè)相對(duì)表達(dá)量升高,4個(gè)相對(duì)表達(dá)量降低。利用western blot方法驗(yàn)證的Al響應(yīng)蛋白變化趨勢(shì)與Luminometer儀檢測(cè)到的蛋白變化趨勢(shì)一致。Al脅迫下,篩選得到3個(gè)表型發(fā)生明顯變化的轉(zhuǎn)基因擬南芥。泛素連接酶At2G39100(L4975)和b HLH家族轉(zhuǎn)錄因子AT1G06170(L2853)對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的相對(duì)根伸長(zhǎng)明顯比野生型長(zhǎng),而At5G05910(L0945)RING型泛素連接酶對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)根伸長(zhǎng)比野生型短。分析表明,L4975蛋白可能通過參與修復(fù)因Al毒害而損傷的DNA、L2853蛋白則可能是通過降低胼胝質(zhì)在根尖的積累,來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Al的抗性。4.E3泛素連接酶At ATRF1基因的功能分析At ATRF1(L4975)是擬南芥中的一個(gè)RING finger型E3泛素連接酶,包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,CDS全長(zhǎng)891 bp,編碼一個(gè)含有296個(gè)氨基酸的蛋白,RING finger結(jié)構(gòu)域位于蛋白的N端。At ATRF1蛋白定位在細(xì)胞核中,且At ATRF1在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)均受Al誘導(dǎo)。At ATRF1在擬南芥中過表達(dá)后提高了擬南芥的耐Al性。已知耐Al基因ALMT1、MATE、STOP1、STOP2、STAR1、ALS1、ALS3和ALT2在At ATRF1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)沒有受到影響,而ATR在At ATRF1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)比野生型擬南芥中的低。據(jù)此推測(cè),At ATRF1轉(zhuǎn)基因擬南芥可能通過At ATRF1直接或間接地與At ATR相互作用來提高其耐Al性。綜上所述,通過本研究,使我們對(duì)低p H和Al脅迫之間的分子水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有了初步認(rèn)識(shí),且發(fā)現(xiàn)了其調(diào)控的相關(guān)性以及獨(dú)立性。篩選得到多個(gè)Al脅迫響應(yīng)蛋白。RING型泛素連接酶基因At2G39100、At5G05910及b HLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因AT1G06170的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型發(fā)生明顯變化。其中,RING型泛素連接酶At ATRF1(At2G39100)可通過直接或間接地與At ATR相互作用提高擬南芥的耐Al性。
[Abstract]:The effects of low p H and Al stress on protein expression in Arabidopsis thaliana were studied . 浠庢嫙鍗楄姤Columbia 4(Col 4)涓厠闅嗗埌60涓漿褰曞洜瀛愬拰40涓硾绱犺繛鎺ラ叾鍩哄洜,騫跺皢鍏舵瀯寤哄埌妞嶇墿琛ㄨ揪杞戒綋p EGAD-LUC,杞寲鍒板啘鏉嗚弻AGL0,鍒╃敤鍐滄潌鑿屼粙瀵肩殑铇歌姳嫻告煋鏂規(guī)硶杞寲鎷熷崡鑺ol 4,騫墮，

本文編號(hào)：1717992