本文選題：基因組穩(wěn)定性　切入點(diǎn)：跨損傷DNA合成　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：細(xì)胞的基因組DNA持續(xù)受到內(nèi)源性因素(如代謝產(chǎn)生的活性氧等)及外源性物質(zhì)(如陽(yáng)光中的紫外線,化學(xué)藥物及電離輻射等)的攻擊,造成不同類型的DNA損傷。這些損傷阻礙了細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程,如果不能得到及時(shí)、精確的修復(fù),將導(dǎo)致基因突變、染色體畸變、細(xì)胞老化或凋亡。因此,細(xì)胞啟用一系列高效的監(jiān)控和修復(fù)途徑來(lái)檢測(cè)、修復(fù)不同類型的DNA損傷,從而維持基因組穩(wěn)定性�？鐡p傷DNA合成(translesion DNA synthesis, TLS)是從酵母到哺乳動(dòng)物都高度保守的DNA損傷耐受機(jī)制,由TLS聚合酶取代高保真的DNA聚合酶,對(duì)受損傷的DNA進(jìn)行復(fù)制。DNA受到損傷后往往結(jié)構(gòu)發(fā)生異變,異變的DNA結(jié)構(gòu)阻礙了DNA聚合酶的復(fù)制進(jìn)程,導(dǎo)致復(fù)制叉停滯,對(duì)處在復(fù)制期的細(xì)胞產(chǎn)生了巨大的威脅。TLS聚合酶的催化中心更靈活,能適應(yīng)不同類型的異變的DNA模板,取代高保真性的DNA聚合酶重新啟動(dòng)暫停的復(fù)制叉,完成DNA的復(fù)制,這對(duì)于維持遭受DNA損傷的細(xì)胞的存活至關(guān)重要。TLS聚合酶主要由Y家族的DNA聚合酶構(gòu)成,包括Polη、Polη、Polκ和REV1。研究表明每種TLS聚合酶傾向于復(fù)制不同類型的損傷模板,從損傷模板中提取正確的遺傳信息。環(huán)境中廣泛存在的紫外線照射常常導(dǎo)致DNA中相鄰的嘧啶堿基發(fā)生交聯(lián),形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體(Cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs).胸腺嘧啶二聚體(T-T dimer)是最常見(jiàn)的CPDs, Po1η能以T-T dimer為模板進(jìn)行復(fù)制,正確地插入A·A堿基。缺失有功能的Polη易患著色性干皮病(XP-V), XP-V患者的細(xì)胞對(duì)UV照射非常敏感,患者在青少年時(shí)期就容易得皮膚癌。調(diào)節(jié)跨損傷DNA合成途徑的關(guān)鍵事件是PCNA的單泛素化修飾。目前大量的研究表明當(dāng)細(xì)胞遭受DNA損傷或遇到復(fù)制壓力時(shí),泛素結(jié)合酶RAD6及泛素連接酶RAD18組成的復(fù)合物特異地對(duì)底物PCNA的第164位賴氨酸進(jìn)行單泛素化修飾。單泛素化的PCNA與Y家族的TLS聚合酶親和力升高,主要是通過(guò)Y家族聚合酶的PCNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。TLS聚合酶取代常規(guī)的復(fù)制聚合酶對(duì)受損的DNA進(jìn)行復(fù)制,重新啟動(dòng)停滯的復(fù)制叉。目前RAD6-RAD18復(fù)合物如何精確地識(shí)別PCNA并對(duì)其進(jìn)行單泛素化修飾的分子機(jī)制并不清楚。我們利用串聯(lián)親和純化的方法研究PCNA的相互作用蛋白,發(fā)現(xiàn)SIVAI在調(diào)節(jié)PCNA的單泛素化修飾過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SIVAI通過(guò)PIP box結(jié)構(gòu)域持續(xù)地與PCNA相互作用。細(xì)胞敲減SIVAI后,UV損傷誘導(dǎo)的PCNA的單泛素化水平降低,TLS聚合酶Polη的招募明顯減少,細(xì)胞對(duì)UV損傷的敏感度和突變率升高。我們證明SIVAI與RAD18直接相互作用,作為接頭蛋白幫助RAD18識(shí)別PCNA,從而促進(jìn)RAD18對(duì)PCNA的單泛素化修飾,保證細(xì)胞能快速地啟動(dòng)跨損傷DNA合成,高效地對(duì)受損傷的DNA進(jìn)行復(fù)制。因此,我們的實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)E3連接酶RAD18識(shí)別其底物PCNA需要接頭蛋白SIVAI,為UV損傷誘導(dǎo)的PCNA單泛素化修飾的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的見(jiàn)解,填補(bǔ)了跨損傷DNA合成途徑中遺留的一個(gè)重要空缺。
[Abstract]:The genome of DNA cells continued to be endogenous factors (such as metabolism of active oxygen) and exogenous substances (such as UV rays, chemicals and ionizing radiation) attacks, causing DNA damage of different types. These injuries hampered the replication and transcription processes in the cell, if they can not get timely and accurate repair that will lead to gene mutation, chromosome aberration, cell senescence or apoptosis. Therefore, cells enable a series of effective monitoring and repair pathways to detect DNA damage repair of different types, in order to maintain genomic stability. Translesion DNA synthesis (translesion DNA, synthesis, TLS) is DNA damage tolerance mechanisms are highly conserved from yeast to mammals and by TLS polymerase to replace the high fidelity DNA polymerase, often on structure damage DNA replication damage.DNA mutation, DNA mutation blocked DNA poly structure The copy process synthase, leading to stalled replication forks, in replicating cells produced a huge threat to.TLS polymerase catalytic center is more flexible and can adapt to different types of mutation of the DNA template, instead of high fidelity DNA polymerase to initiate replication fork suspension, complete DNA replication, which is to maintain suffer the damage of DNA cell survival is mainly composed of Y.TLS polymerase family DNA polymerase, including Pol, Pol, Pol, K and REV1. research shows that each template damage TLS polymerase tended to replicate the different types of extraction of genetic information correctly from the damage mode of the board. The environment is often lead to ultraviolet irradiation pyrimidine bases in DNA adjacent crosslink formation of cyclobutane pyrimidine dimers (Cyclobutane pyrimidine two dimers, CPDs). Two thymine dimer (T-T dimer) is the most common CPDs, Po1 to T-T di. Mer as the template for replication, correctly inserted into the A A base. The lack of functional Pol is susceptible to xeroderma pigmentosum (XP-V) patients, XP-V cells are very sensitive to UV irradiation, patients easily at a young age to skin cancer. Key events regulate translesion DNA synthesis pathway is monoubiquitinated modification of PCNA. Many studies have shown that when the cells were subjected to DNA damage or replication encountered pressure, complex ubiquitin conjugating enzyme RAD6 and the ubiquitin ligase RAD18 composed of specific substrate PCNA 164th lysine of monoubiquitin. Increased ubiquitination of PCNA and Y family TLS polymerase affinity, mainly the family of Y polymerase PCNA binding domain and ubiquitin binding domain to achieve.TLS polymerase of conventional polymerase substituted replication of damaged DNA replication, restart the stalled replication forks. At present RAD6-RAD18 complexes How to accurately identify PCNA and its molecular mechanism of monoubiquitin is not clear. We use a series of interacting protein affinity purification method of PCNA, found that SIVAI played an important role in the process of modification of single ubiquitin mediated PCNA. Our experimental results show that the SIVAI through the PIP box domain continuously the interaction with PCNA cells. Knockdown of SIVAI, ubiquitination of UV damage induced by PCNA level decreased, the recruitment of TLS polymerase Pol is significantly reduced, the sensitivity of cells to UV damage and mutation rate increased. We prove that SIVAI and RAD18 interact directly, as adapter proteins help identify RAD18 PCNA, so as to promote RAD18 monoubiquitin to PCNA, to ensure the cell can quickly start translesion DNA synthesis and replication of damaged DNA efficiently. Therefore, our experiment innovatively found that E3 is connected with the enzyme RAD 18, recognition of its substrate PCNA requires a joint protein SIVAI, which provides new insights into the regulatory mechanism of UV damage induced PCNA ubiquitination modification, and fills an important gap left in the cross injury DNA synthesis pathway.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：1670800